液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对保健食品中30种降糖类非法添加化合物的快速定性检测

摘 要：目的：建立液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对保健食品中30种降糖类非法添加化合物的快速定性检测方法。方法：样品经甲醇超声提取后，采用Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm×3.0 mm，

2.7 µm）色谱柱，10 mmol·L-1甲酸铵的0.1%（v/v）甲酸溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱。30种化合物采用电喷雾离子化正离子检测模式进行分析，建立30种化合物的分子式、一级精确质量、二级碎片离子以及保留时间在内的质谱数据库；在全离子扫描模式下，通过化合物的色谱保留时间、精确质量数、同位素分布和丰度比等信息进行定性匹配；在Target MS/MS模式下，通过二级碎片离子匹配进一步确证，同时以分子离子峰的峰面积定量，实现保健食品中多目标化合物的快速定性定量筛查。结果：该方法能同时实现30种降糖类化学物的快速定性筛查确证，30种化合物在各自的浓度范围内线性良好（r2＞0.99），检出限为5～

20 ng·mL-1。在50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的加标水平下，30种化合物在2种基质中的平均回收率在68.7%～110.5%，平均RSD均小于13%。实际样品中筛查出2批添加盐酸二甲双胍。结论：该方法快速、高效、准确、扩展性强，适用于保健食品中降糖类非法添加化合物的高通量快速定性筛查。

关键词：液相色谱-四极杆飞行时间质谱法；降糖；非法添加；保健食品

Rapid Qualitative Detection of 30 Anti-diabetic Compouds in Health Foods by Liquid Chromatography-Quadrupole/Time-of-Flight Mass Spectrometry

WANG Chengshuai， SHU Zhan， ZHENG Lanjun， YING Binbin， JIN Qin

（Jinhua Institute for Durg & Food Control， Jinhua 321000， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid qualitative detection method for 30 illegally added hypoglycemic compounds in health food using liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Method： After ultrasonic extraction with methanol， the sample was extracted using Agilent Poroshell 120 EC-C18 （150 mm×3.0 mm， 2.7 µm） chromatographic column was used， with a 0.1% （v/v） formic acid solution of 10 mmol·L-1 ammonium formate and acetonitrile as the mobile phase for gradient elution. 30 compounds were analyzed by electrospray ionization positive ion detection mode， and a mass spectrometry database including the molecular formula， primary accurate mass， secondary fragment ions and retention time of 30 compounds was established; in the full ion scanning mode， qualitative matching is performed through information such as the chromatographic retention time， accurate mass number， isotope distribution， and abundance ratio of the compound; in Target MS/MS mode， further confirmation is achieved through secondary fragment ion matching， while quantifying the peak area of molecular ion peaks to achieve rapid qualitative and quantitative screening of multi-objective compounds in health food. Result： This method can simultaneously achieve rapid qualitative screening and confirmation of 30 hypoglycemic chemicals， and the 30 compounds have good linearity within their respective concentration ranges （r2＞0.99）， with a detection limit of 5～

20 ng·mL-1. At spiked levels of 50 ng·mL-1， 100 ng·mL-1， and 200 ng·mL-1， the average recoveries of 30 compounds in two matrices ranged from 68.7% to 110.5%， the average RSD is less than 13%. Two batches of metformin hydrochloride were screened from the actual samples. Conclusion： This method is fast， efficient， accurate， and highly scalable， and is suitable for high-throughput rapid qualitative screening of illegally added hypoglycemic compounds in health food.

Keywords： liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry; reduce blood sugar; illegal addition; health food

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，长期的高血糖会导致组织器官的慢性病变和功能性障碍。目前在全球范围内，糖尿病的患病率和发病率急剧攀升。我国糖尿病患病率也呈快速增长趋势，2017年中国有糖尿病患者1.1亿，居世界首位。降糖类药物作为治疗糖尿病，维护机体正常功能的长期药品，种类多、用量大，按照作用机制可分为促胰岛素分泌剂类、二甲双胍类、糖苷酶抑制剂类、噻唑烷二酮衍生物以及DPP-4酶抑制剂等八大类。受利益驱动，生产商会在某些不正规的保健食品中添加降糖类化学物，而消费者在不知情的情况下购买和使用该产品，会引起用药安全问题。针对此现象，国家药品监管部门先后在2009年、2011年、2013年分别发布了3个补充检验的标准[1-3]，用于筛查13种降糖类的化合物。该法采用薄层色谱法和高效液相色谱法进行初筛，质谱法确证，液相法定量，过程烦琐，不适合大批量样品的快筛。另外，13种化合物远未包含临床使用的其他类降糖药物。因此，建立一种快速针对更多药物的准确、高效、广谱的筛查方法，对补充标准的局限性，降低假阴/阳性的风险，保障食品安全具有重要意义。

目前，关于保健食品中降糖类药物的检测方法主要有光谱法[4-5]、离子迁移谱法[6]、薄层色谱法[7-8]、高效液相色谱法[9-10]和液质联用法[11-14]等。其中，液质联用法具有灵敏度高、准确度强、高通量的特点，是目前采用最多的分析技术。液质法根据仪器的不同原理，主要有三重四极杆的定性定量报道[15-16]。该方法的定量准确，但定性略有不足，不能随时增加化合物，且扩展性不佳；而飞行时间质谱属于高分辨质谱，可精确测定分子质量数和二级质谱，具有高特异性、高通量、高扫描速度等优势，能快速进行定性筛查，可实现无标样的定性分析。利用飞行时间质谱进行添加降糖类化合物的分析也偶有报道[17]。因此，本研究建立液相色谱四极杆飞行时间质谱筛查保健食品中非法添加30种降糖化合物的快速定性确证方法，理清筛查的流程和思路。本方法前处理简单、准确度高，能满足日常监管的需求。

1 材料与方法

1.1 样品

样品为日常市场监督抽样，以胶囊剂、片剂、口服溶液类的保健食品为主。

1.2 试剂

对照品：盐酸二甲双胍、盐酸丁双胍、盐酸苯乙福明、罗格列酮、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、格列齐特、格列波脲、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、利格列汀、维格列汀、沙格列汀、磷酸西格列汀、那格列奈、阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇，购自中国食品药品检定研究院；妥拉磺脲、达格列净、卡格列净、曲格列酮、GW501516，购自曼哈格（上海）生物科技有限公司；氯磺丙脲、莫格他唑，购自坦墨质检；苯甲酸阿格列汀，购自上海源叶生物科技有限公司；恩格列净，购自广州佳途科技股份有限公司；上述对照品纯度均≥98.0%；甲醇、乙腈（色谱纯），Merck公司；甲酸、乙酸、乙酸铵（色谱纯），上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.3 仪器与设备

Agilent 1260-6530HPLC-QTOF液质联用仪（美国安捷伦公司）；XPE250DR电子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ250DE超声波仪（功率250 W，频率

40 kHz，昆山超声波仪器公司）；Minispin plus高速离心机（德国Eppendorf公司）；Direct-Q5UV型超纯水机（美国Millipore公司）；0.22 µm针式尼龙滤膜（美国Millipore公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm×

3.0 mm，2.7 µm）；柱温：35 ℃；流动相：A相为

10 mmol·L-1甲酸铵的0.1%（v/v）甲酸溶液，B相为乙腈；梯度洗脱：0～2 min，95%A；2～8 min，95%A

～65%A；8～20 min，65%A～10%A；20～30 min，10%A；30.0～30.1 min，10%～95%；30.1～40.0 min，95%；进样体积：1 µL；流速：0.3 mL·min-1。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：3 500 V；诱导碰撞解离电压：

140 V；雾化气压力：35 psi；载气：氮气；干燥气温度：320 ℃；干燥气流速：12 L·min-1；一级质谱采集范围：m/z 100～800，为全扫描模式；二级质谱采集范围：m/z 50～600，采集为自动目标模式；采集速率：2 spectra/s；碰撞能量：10 eV、20 eV、40 eV；选用参比离子m/z 121.050 9、m/z 922.009 8实时质量校正。

1.4.3 溶液的制备

（1）标准溶液的制备。分别精密称取上述30种对照品约5 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL各含约100 µg的混合对照品储备液，放置-20 ℃保存。精密取上述对照品储备液各0.5 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇-水混合液（4∶1，v/v）定容，制成每1 mL各含约1 µg的对照品混合溶液。

（2）供试品溶液的制备。对于固体制剂，取样研细后，称取约0.2 g置于200 mL量瓶中，对于液体制剂，取0.5 mL置于200 mL量瓶中，分别加入约