醇提法提取河蚬活性成分的工艺研究

摘 要：以河蚬软体部分为原料，以乙醇脱氢酶激活率为指标，采取单因素和正交试验优化95%乙醇提取河蚬活性成分的工艺条件。结果表明，最佳工艺条件为料液比1∶6（g∶mL）、提取时间4 h、提取温度为70 ℃，该条件下乙醇脱氢酶的激活率为40.00%。

关键词：河蚬；活性成分；提取工艺；乙醇脱氢酶

Study on the Technology of Extracting Active Ingredients from Corbicula fluminea by Alcohol Extraction

XU Yanlong

（Quanzhou Market Supervision Comprehensive Law Enforcement Detachment， Quanzhou 362000， China）

Abstract： Using the soft parts of Corbicula fluminea as raw materials， and taking the alcohol dehydrogenase activation rate as an indicator， single factor and orthogonal experiments were used to optimize the process conditions for extracting active ingredients from Corbicula fluminea with 95% ethanol. The results showed that the optimal process conditions were a solid-to-liquid ratio of 1∶6 （g∶mL）， an extraction time of 4 h， and an extraction temperature of 70 ℃. Under these conditions， the activation rate of alcohol dehydrogenase was 40.00%.

Keywords： Corbicula fluminea ; active ingredient; extraction process; alcohol  dehydrogenase

河蚬（Corbicula fluminea）又称金蚶、扁螺等，有开胃、通乳、明目、利小便、治脚气、去湿毒及醒酒等功效。《本草纲目》中记载，河蚬具有治肝病、解酒毒等疗效[1]，其繁殖能力强且对环境的适应能力强，所以容易进行人工养殖，拥有较好的经济效益。近年来，科研人员对河蚬活性成分提取和功能展开的研究较多，但对河蚬活性成分的研究尚未深入。本文采用95%乙醇提取河蚬的活性成分，以乙醇脱氢酶激活率为指标，采取单因素和正交试验优化确定最佳提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活河蚬：购买于泉州后埔菜市场（来源于泉州水库），暂养，清水放置，待其吐沙一段时间。放置于沸水中热烫约10 s至微开壳，用镊子将河蚬软体部分取出，用刀剁碎成河蚬肉泥，备用。

氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）：中国医药集团上海化学试剂公司；乙醇脱氢酶（生化级）：购自Sigma公司；95%乙醇；焦磷酸钠缓冲液；磷酸盐缓冲液。

1.2 仪器与设备

UV-2102 PCS紫外分光光度计：龙尼柯仪器有限公司；TDL-40B飞鸽离心机：上海康亭科学仪器厂；HH-2恒温水浴锅：邦西仪器科技（上海）有限公司；2004型万分之一天平：上海恒平电子天平有限公司；PH-3C微型机pH计：上海康仪仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；BCD-216TDXZA型冰箱：海尔集团公司。

1.3 试验方法

1.3.1 河蚬醇提物（95%）的制备

称取10 g（用50 mL小烧杯盛放处理好的河蚬肉，在电子天平上称量）河蚬肉置于250 mL烧杯中，以95%乙醇作为提取剂，在一定温度、一定料液比下提取一定时间。提取结束后，在转速4 000 r·min-1条件下离心15 min，而后通过旋转蒸发、冷冻干燥制得河蚬醇提物（95%），备用[2]。

1.3.2 单因素实验设计

河蚬醇提物的乙醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase，ADH）激活率与料液比、提取温度、提取时间等因素密切相关，因此以这3个因素为变量进行单因素试验。

（1）考察料液比对ADH激活率的影响。在1.3.1基础上，设置提取温度为60 ℃、时间为3 h，考察料液比分别为1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2（g∶mL）（以河蚬肉质量计）对ADH激活率的影响，确定最佳料液比。

（2）考察提取温度对ADH激活率的影响。在1.3.1基础上，设置提取料液比为1∶5（g∶mL）、提取时间为3 h，考察提取温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃对ADH激活率的影响，确定最佳提取温度。

（3）考察提取时间对ADH激活率的影响。在1.3.1基础上，设置提取料液比为1∶5（g∶mL）、提取温度为70 ℃，考察提取时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h对ADH激活率的影响，确定最佳提取时间[3]。

1.3.3 正交试验设计

由于提取时间、提取温度以及料液比之间存在相互关系，因此在单因素实验的基础上，以提取时间、提取温度、料液比为因素，以ADH激活率为指标，通过L9（34）正交试验优化河蚬活性成分的提取工艺条件[4]。正交试验水平因素如表1所示。

1.3.4 乙醇脱氢酶激活率测定

将冷冻干燥后的河蚬提取物配制成相同浓度的水溶液。取试管两支，1支作为测定管（A1），1支作为空白调零管（A2）。A1加入1.5 mL pH值为8.8的焦磷酸钠缓冲液、1.0 mL浓度为27 mmol·L-1的氧化型辅酶Ⅰ、0.5 mL体积分数为11.5%的乙醇溶液以及0.1 mL的河蚬提取物。A2加入1.5 mL pH值为8.8的焦磷酸钠缓冲液、1.6 mL蒸馏水[5]。混合摇匀后，放置于水浴锅中25 ℃下温育5 min。往温育后的测定管中立即加入0.1 mL ADH（0.25 U·mL-1），摇匀。用分光光度计测定吸光度（340 nm），每隔

10 s读数一次，连续读数5 min，直至每分钟吸光度的增大值达到稳定为止，取反应最初的线性部分作图。进行参比调零，取一支试管作为对照管（A3），以0.1 mL蒸馏水代替0.1 mL河蚬提取物，重复上述步骤，测定对照组的乙醇脱氢酶活力[6]。ADH活力和激活率计算公式为

ADH活力（U·mg-1）=（E340×3.1）/（6.2×Ew）（1）

ADH激活率=（ADH活力测定组-ADH活力对照组）/

ADH活力对照组×100%（2）

式中：E340为340 nm处每分钟吸光度的增大

值；Ew为每毫升所用酶液含酶量，mg；6.2为ADH的克分子吸光度系数；3.1为试液的总体积，mL[7]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对醇提物ADH激活率的影响

由图1可知，当料液比由1∶2至1∶5时，醇提物对ADH激活率逐渐提高，在料液比为1∶5时ADH激活率达到最高（28.57%），继续提高料液比，ADH激活率将呈现下降趋势。因此最佳料液比选取1∶5。

图1 料液比对95%醇提物ADH激活率的影响

2.1.2 提取温度对醇提物激活ADH的影响

由图2可知，随着温度升高，反应速率增快，ADH的激活率增大，最高达到33.33%。当温度超过70 ℃时，河蚬醇提物对ADH的激活率开始下降，所以95%乙醇提取最适温度为70 ℃。

图2 提取温度对95%醇提物ADH激活率的影响

2.1.3 提取时间对醇提物激活ADH的影响

由图3可知，提取初期（1～4 h），醇提物的ADH激活率随着提取时间的延长呈上升趋势。提取4 h时，ADH激活率最高达到28.57%。继续延长反应时间，ADH激活率开始降低，因此最佳提取时间确定为4 h。

2.2 正交实验结果

由表2可知，优化水平组合为A3B3C2，即料液比为1∶6、提取温度为70 ℃、提取时间为4 h。为进一步验证是否为最优提取方案，对上述实验结果进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，影响ADH激活率各因素的主次顺序为提取温度＞提取时间＞料液比。提取温度对ADH激活率的影响达到极显著水平（P＜0.01），提取时间对ADH激活率的影响达到显著水平

（P＜0.05）。因此选择料液比1∶6（g∶mL）、提取时间4 h、提取温度为70 ℃进行提取条件验证，在此条件下测得ADH激活率为40.00%。说明此优化条件下参数准确可靠，具有一定实用价值。

3 结论

为深入开发河蚬的保健功效，本文通过醇提工艺对河蚬活性成分进行了提取，通过单因素实验和正交实验对提取条件进行了优化。结果表明，对95%醇提物ADH激活率影响最大的因素为提取温度，达到极显著水平（P＜0.01），其次为提取时间，达到显著水平（P＜0.05）。95%乙醇提取河蚬活性成分的最佳提取工艺条件为料液比1∶6（g∶mL）、提取时间4 h、提取温度70 ℃，此条件下河蚬醇提物的ADH激活率为40.00%。

参考文献

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[3]黄国平，温其标，杨晓泉，等.超声波法提取玉米醇溶蛋白的研究[J].食品与发酵工业，2002，28（10）：1-5.

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