不同可可含量巧克力中咖啡因和可可碱的差异性分析

作者: 蒋薇 姚力文 许志刚 邢亚杰 刘志华 李振杰


摘 要:本文建立了利用气相色谱-三重四极杆串联质谱(Gas Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry,GC-MS/MS)同时测定不同巧克力中咖啡因和可可碱含量的分析方法。样品通过液氮冷萃后粉碎,再经甲醇超声提取30 min,采取多反应监测模式检测,内标标准曲线法定量。结果表明,可可碱和咖啡因在各自的线性范围内拥有良好的线性关系(r2>0.99),在低、中、高3个水平下加标回收率分别为77.90%~115.47%和86.69%~114.26%,相对标准偏差分别为1.43%~2.48%和1.30%~2.11%;对市售7种具有不同可可浓度的巧克力样品进行分析,检测可得样品中咖啡因及可可碱含量与其可可含量呈正相关。该方法适用于巧克力及可可类样品中的咖啡因和可可碱的同时快速定量分析。

关键词:气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS);巧克力;咖啡因;可可碱

Difference Analysis of Caffeine and Theobromine in Chocolate with Different Cocoa Content

JIANG Wei1, YAO Liwen2, XU Zhigang3, XING Yajie4, LIU Zhihua1, LI Zhenjie1*

(1.Yunnan Key Laboratory of Tobacco Chemistry, R&D Center of China Tobacco Yunnan Industry Co., Ltd., Kunming 650231, China; 2.School of Chemical Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China; 3.Faculty of Science, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China; 4.Yunnan Kunfa Environment Tech Co., Ltd., Kunming 650231, China)

Abstract: In this paper, an analytical method was developed for the simultaneous determination of caffeine and theobromine in different chocolates using gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). The sample was crushed after cold extraction with liquid nitrogen, and then subjected to methanol ultrasonic extraction for 30 minutes. Next, the samples were detected in multiple reaction monitoring mode and quantified by internal standard curve. The results indicate that theobromine and caffeine had a good linear relationship within their respective linear ranges (r2>0 99), the average recovery rates in low, medium as well as high levels are 77.90%~115.47%和86.69%~114.26% respectively, with relative standard deviation (RSD) of 1.43%~2.48% and 1.30%~2.11% respectively; the content of caffeine and theobromine in 7 kinds of chocolate samples with different cocoa concentrations on the market were positively correlated with their cocoa content. This method is suitable for the simultaneous rapid quantitative analysis of caffeine and theobromine in chocolate and cocoa samples.

Keywords: gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (GC-MS/MS); chocolate; caffeine; theobromine

咖啡因和可可碱作为生物碱,具有明显生理作用,广泛存在于咖啡、茶叶、巧克力等食品中,其中巧克力作为当下流行的食品之一,深受人们的喜爱。可可含量是巧克力品质的量化标准之一,咖啡因和可可碱含量也是评价巧克力品质的重要指标。可可碱和咖啡因具有控制血压、减少心脏病风险等优点,适量摄入可可碱和咖啡因对人体健康具有显著益

处[1-5]。目前,常见的检测咖啡因和可可碱的方法包括高效液相色谱法[6-9]、超高效液相色谱-串联质谱法[10]、液相色谱-时空质谱法[11]、紫外分光光度法[12]、气相色谱-质谱联用法等[13-15]。而采用GC-MS/MS对食品中的咖啡因和可可碱同时进行检测的文献鲜有报道。GC-MS/MS作为一种简单、快捷的检测方式,不仅能对常规的食品中的成分进行鉴定,也适用于巧克力等复杂基质的样品的测定。本文对市售7种巧克力的前处理条件及可可碱标品的溶剂进行优化,借助GC-MS/MS建立了一种操作简便、测定周期短、检测效果准确的可可碱和咖啡因检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

市售不同可可含量的7种黑巧克力(可可含量在58%~90%)。色谱纯级无水乙醇和色谱纯级甲醇,德国Merck公司;咖啡因标准品、可可碱标准品和萘标准品购买于上海Macklin公司。

SCION 456 GC-TQ气相色谱-三重四极杆质谱仪,美国Bruker公司;AG 135型电子天平,瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确定量称取0.05 g萘,置于10 mL容量瓶中,往容量瓶中加入适量甲醇稀释并定容,从而配制得到内标储备液,质量浓度为5 000 mg·L-1;移取内标储备液0.2 mL于1 000 mL容量瓶中,用适量甲醇稀释并定容,配制完成内标标准工作液,质量浓度

为1 mg·L-1。

准确定量称取0.05 g咖啡因,置于10 mL容量瓶中,往容量瓶中加入适量甲醇稀释并定容,配制得到咖啡因标准储备液,质量浓度为5 000 mg·L-1;定量称取可可碱0.002 5 g,置于25 mL的容量瓶中,用70%乙醇稀释并定容,再放入超声机超声2 min后溶解,得到100 mg·L-1的可可碱标准储备液。用甲醇分别稀释上述两种标准储备液,并配制质量浓度为0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、

5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1的系列标准工作溶液,并在系列标准工作溶液加入适量的内标标准工作溶液,控制内标萘的质量浓度在1 mg·L-1。上述所有溶液均放置于4 ℃冰箱中保存,使用前再拿出置于室温下回温。

1.2.2 样品前处理

称取适量市售巧克力,掰成碎块置于烧杯中,加入液氮使其温度降低,之后放入高速粉碎机粉碎,准确称取粉碎后的巧克力0.05 g(精确到0.1 mg),加入10 mL 1.2.1中配制好的内标标准工作液,放入超声机内超声30 min后,取上层萃取液,经孔径为

0.22 μm的微孔滤膜过滤后取1 mL左右供仪器分析。

1.2.3 仪器条件

色谱柱为DB-5MS毛细管柱(60 m×0.25 mm,

0.25 μm);进样口温度为250 ℃;流速为1 mL·min-1;分流比为10∶1;升温程序调整为初始温度50 ℃,在此状态下保持2 min,再以20 ℃·min-1升温至250 ℃,在此状态下保持8 min;总分析时间为20 min。离子源为EI源;离子源温度为170 ℃;传输线温度为250 ℃;电离能为70 eV;灯丝电流为80 μA;碰撞气为纯度99.999%的氩气;检测模式为多反应监测(MRM)模式;每个离子的检测时间为100 ms。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

2.1.1 可可碱标准品储备液配制溶液优化

通过文献调研得知,可可碱不溶于苯、醚、氯仿和四氯化碳等常用有机溶剂,但略溶于水和乙醇的混合物,故尝试使用不同比例的乙醇和水混合物对可可碱进行溶解性实验。本实验分别使用95%、90%、85%、80%、75%、70%的乙醇/水溶液对可可碱进行溶解。结果表明70%的乙醇/水溶液中可可碱的分散效果最好。该溶液呈澄清透明状,且经历一段时间的静置后未发生复析。后续标准工作溶液用无水乙醇定容,在使样品能进入气相色谱进行分析的同时,避免水分含量过多而破坏仪器功能。

2.1.2 萃取溶剂优化

对样品的萃取溶剂优化。采用相同的巧克力样品,选用甲醇和乙醇作为萃取溶剂,不同溶剂萃取后得到咖啡因和可可碱浓度见图1。分别用甲醇和乙醇对巧克力样品进行萃取,经GC-MS/MS分析后,甲醇萃取的样品得到的咖啡因和可可碱的浓度较大,故选用甲醇作为萃取溶剂。

图1 不同萃取溶剂对咖啡因和可可碱浓度的影响

2.1.3 萃取方式

巧克力样品基质复杂,需要进行一定的前处理以保证提取充分。本文设计了不研磨、研钵研磨、机器研磨、介质碰撞(以小球为介质在高速运转的转子下,将样品进行打碎混匀)4种样品前处理方式。其中用研钵研磨、机器研磨这两种方式处理时加入液氮以使巧克力不因为温度过高而融化。不同前处理方式对样品中可可碱及咖啡因的GC-MS/MS分析结果见图2。由图2可知,4种处理方式中介质碰撞、机器研磨两种方式得到的咖啡因和可可碱的浓度最大。比较两种效果较好的处理方式,机器研磨的方法较为便捷、快速且误差较小,故后续实验选用机器研磨作为前处理方式。

2.2 质谱参数的优化

先通过全扫描方式确定每种物质的保留时间,并且由此选择出适当的母离子来进一步分析样品,在母离子扫描的基础上再利用PRODUCT扫描模式,借助碰撞池使母离子发生裂解产生子离子提供更多碎片化信息,并对选择出的母离子进行第二次质谱分析,采用多反应监测模式来优化各自的碰撞能量电压,最终确定出定性离子对、定量离子对和各个物质的二级质谱参数,分别实现对物质的定性、定量识别和分析。咖啡因、可可碱和萘的保留时间、定性、定量离子对及碰撞能见表1。

图2 不同前处理方式对咖啡因和可可碱浓度的影响

2.3 线性关系、回收率和精密度

采用气相色谱-三重四极杆串联质谱方法对可可碱和咖啡因的系列标准工作溶液进行测定,纵坐标(y)为可可碱和咖啡因与内表峰面积的比值、横坐标(x)为可可碱和咖啡因与内标物质量浓度的比值,以此绘制标准曲线,得到的可可碱和咖啡因曲线在各自的线性范围内拥有良好的线性关系,相关系数(r2)均大于0.99,见表2。

为验证方法准确性,对巧克力样品进行了低、中、高3个水平下(15 mg·L-1、40 mg·L-1、65 mg·L-1)的加标回收率实验,按1.2.2节所描述的方法进行样品前处理,每个添加水平做5个平行样品,测定可可碱和咖啡因的含量,并根据加标量、加标前后的测量结果计算出加标回收率和相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)。可可碱和咖啡因的回收率分别为77.90%~115.47%和86.69%~114.26 %,RSD分别为1.43%~2.48%和1.30%~2.11%(表3)。咖啡因、可可碱和萘的标准溶液总离子流色谱图见图3。

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