HPLC-MS法测定牛奶中头孢噻呋残留量的不确定度评估
作者: 朱勇抗
(GB/T 21314—2007)测定牛奶中头孢噻呋的残留量,并评估测量结果的不确定度。结果表明,头孢噻呋测定结果为(64.8±5.8)μg·kg-1,置信区间为95%,包含因子k=2。测定牛奶中头孢噻呋的不确定度主要来源于标准工作液配制、标准曲线校准样品浓度。对此,应根据待测目标物的预估进样浓度,使用高精度量具配制标准工作液,以提高检测结果的准确性。
关键词:液相色谱-质谱/质谱法;头孢噻呋;不确定度
Evaluation of Uncertainty in the Determination of Ceftiofur Residue in Milk by HPLC-MS
ZHU Yongkang
(Guangdong Hongke Testing Technology Co., Ltd., Huizhou 516100, China)
Abstract: The residue of ceftiofur in milk was determined according to GB/T 21314—2007, and the uncertainty of the measurement results was evaluated. The results showed that the result of ceftiofur was (64.8±5.8) μg·kg-1 with the confidence interval of 95% and the inclusion factor k=2. The uncertainty of the determination of ceftiofur in milk was mainly due to the preparation of the standard working solution and the concentration of the sample for calibration of the standard curve. In this regard, the standard working solution should be prepared according to the predicted injection concentration of the target to be measured, and the standard working solution should be prepared using a high-precision gauge to improve the accuracy of the results.
Keywords: liquid chromatography-tandem mass spectrometry; ceftiofur; uncertainty
头孢类抗菌药物对革兰氏菌所致的炎症具有显著疗效[1],所以在畜禽养殖业中,它作为一种特殊的药物用于防治呼吸道感染、消化道感染、尿路感染等疾病。然而,在防治畜禽病害时,往往会因为使用者的不合理应用等导致头孢噻呋残留,然后通过食物链富集,损害人体的肝肾功能[2],同时可能产生过敏反应,严重时甚至引起休克[3]。因此,全球多个国家都对其最大残留量进行了限制。本实验按照《动物源性食品中头孢匹林、头孢噻呋残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》(GB/T 21314—2007)[4]测定了牛奶中头孢噻呋的残留量,并依据《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)[5]对不确定度进行评估,以保证结果准确。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛奶,购自惠州罗阳镇金铂广场;乙腈(高效液相色谱级),德国Merck;磷酸二氢钾(优级纯),国药集团;氯化钠(分析级),天津大茂;头孢噻呋标准物质(1 000 mg·L-1),德国Dr. Ehrenstorfer;水均为GB/T 6682—2008规定的一级水,由Minipole超纯水系统制备。
1.2 仪器与设备
PX223ZH/E电子天平,奥豪斯仪器(常州)有限公司;T25均质机,德国IKA;TTL-DCⅡ氮吹仪,北京同泰;TRIPLE QUAD 4500液相色谱质谱联用仪,美国AB SCIEX。
1.3 实验方法
1.3.1 样品处理
(1)萃取。称样本10.00 g于50 mL的离心管内,添加20 mL乙腈水(15∶2,V/V),均匀萃取30 s,离心5 min,将上清液转移至50 mL的离心管内;在另一个离心管中,添加10 mL乙腈水(15∶2,V/V),清洗均匀器头,用玻璃棒粉碎离心管内的沉淀物,再将以上清洗均匀器头溶液加入其中,用旋转搅拌器搅拌1 min,将所得的上清液合并到50 mL的离心管内进行混合;用乙腈将其定容至50 mL,精确地吸取25 mL溶液到100 mL的鸡心玻璃瓶中,用旋转蒸发器(37 ℃水浴)蒸干其中乙腈。
(2)纯化。将25 mL的磷酸盐缓冲溶液
(0.05 mol·L-1)添加到已经去除了乙腈的鸡心瓶中,搅拌1 min;用适当的氢氧化钠将pH值调整到8.5,通过预先处理过的固相萃取柱(500 mg,6 mL);用2 mL的磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol·L-1)冲洗2次,用1 mL的超纯水进行淋洗;用3 mL的乙腈进行洗脱(速率控制为1 mL·min-1),45 ℃氮气吹洗洗脱液;用
0.025 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液定容到1 mL,通过
0.45 μm滤膜,立即用仪器测量[4]。
1.3.2 仪器条件
(1)色谱条件。色谱柱:COSMOSIL C18柱
(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:A组分是
0.01 mol·L-1乙酸铵溶液(pH=4.5),B组分为乙腈;流
速:1.0 mL·min-1;进样量:100 μL。
(2)质谱条件。离子源:ESI+;检测方式:多反应监测;电喷雾电压:5 500 V;雾化气压力(GS1):0.414 MPa(60 Psi);气帘气压力(CUR):0.207 MPa(30 psi);辅助气压力(GS2):0.621 MPa(90 psi);离子源温度(TEM):700 ℃。头孢噻呋的定性离子对、定量离子对、碰撞能量见表1。
1.4 数学模型
根据以上测定过程建立数学模型为
(1)
式中:X为牛奶中头孢噻呋含量,μg·kg-1;C为牛奶中头孢噻呋经校准曲线计算得出的浓度,μg·L-1;V为样品最终的定容体积,mL;m为最终样液代表的试样质量,g。
2 结果与分析
2.1 不确定度来源分析
通过分析可知采用外标法测定牛奶中头孢噻呋的不确定度主要来源于样品的称量过程、样品的提取过程、标准工作液配制过程、样品测量的重复性、检测设备、标准曲线校准样品浓度等。
2.2 样品称量过程的不确定度分析
称量过程中,称量样品1次,采用鉴定为Ш级、精度为0.01 g的天平,当称样量为10.00 g时,天平允差为±0.005 g,按照均匀分布,k1,其标准不确定度为;转化为相对标准不确定度为。
2.3 样品移取和定容的不确定度分析
实验过程中,使用了25 mL A级分度吸量管,50 mL A级容量瓶和0.01~1.00 mL移液器3种经校准合格的量器,均按照均匀分布,,可得使用量具引入的相对不确定度的平方,见表2。
实验过程中所用量器引入的相对标准不确定度为
2.4 标准工作溶液配制不确定度分析
2.4.1 标准物质自身引入的相对标准不确定度
头孢噻呋的浓度为1 000 mg·L-1,其扩展不确定度U=7 mg·L-1,属正态分布,包含因子k3=2,其标准不确定度为,相对标准不确定度为。
2.4.2 配制标准中间液引入的相对标准不确定度
标准中间液配制参照标准,吸取标准溶液
0.50 mL用磷酸盐缓冲液定容到100 mL,配成
5 000 ng·mL-1的标准中间液。稀释过程中采用100~1 000 μL移液器,吸取0.50 mL溶液的允差为±0.010 mL,按照均匀分布,,其相对标准不确定度为。用A级
100 mL容量瓶定容,允差为±0.10 mL,按照均匀分布,,其相对标准不确定度为。因此配制标准中间液引入的相对标准不确定度为
2.4.3 标准工作液配制引入的相对标准不确定度
用校准过的移液枪分别准确吸取0.10 mL、
0.20 mL、0.40 mL、0.50 mL和0.80 mL的头孢噻呋标准中间液到5 mL容量瓶中,用无检出头孢噻呋的牛奶样品基质提取液稀释定容,其浓度分别为
100 μg·L-1、200 μg·L-1、400 μg·L-1、500 μg·L-1和800 μg·L-1。由移液器校准证书和JJG 196—2006[4]可知移液器、A级容量瓶的最大容量允差,按均匀分布()计算,可得使用移液枪、容量瓶引起的相对不确定度的平方,见表3。
标准工作液配制过程中所用量器引入的相对标准不确定度为
综上,可将标准工作液配制引入的相对标准不确定度合成为
2.5 样品测定重复性的不确定度分析
本次对样品独立测试了2次,结果为321 μg·L-1、328 μg·L-1,平均结果为324 μg·L-1,样品中头孢噻呋含量为64.8 μg·kg-1,相对偏差为2.2%。按照正态分布(95%置信区间,k=2)计算,相对标准不确定度为
2.6 测定仪器的不确定度分析
本次实验采用的是经校准合格的HPLC-MS,根据证书,其重复性为0.033,按照均匀分布(),换算成相对标准不确定度为
2.7 标准曲线校准样品浓度时引入的不确定度
按2.4.3操作,配制5个校准点,其平均值μg·L-1,仪器响应值和标准点浓度见表4。
以试样浓度作横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到曲线方程为y=bx+a=4.334x-25.4,最小二乘法拟合曲线的相关系数r2为0.998 6,标准曲线残差标准差为
重复测量提取溶液两次得浓度为321 ng·mL-1、323 ng·mL-1,即平均值为c=322 ng·mL-1,其中n代表标准曲线点的个数(n=5),p代表样品溶液的平行测定次数(p=2)。用最小二乘方法对标准曲线进行拟合时,所引进的不确定度为
用标准曲线进行拟合时,产生的相对标准不确定度为
2.8 合成相对标准不确定度
各来源的相对标准不确定度数值见表5,得到合成相对标准不确定度为
2.9 相对扩展不确定度和扩展不确定度
置信区间为95%时,k=2,相对扩展不确定度为Urel=k×ucrel(W)=2×0.044=9.0%
本次测量样品中头孢噻呋含量为64.8 μg·kg-1,则其扩展不确定度为U=64.8×9.0%=5.8 μg·kg-1
3 结论
本文依据GB/T 21314—2007采用液相色谱-串联质谱法测定了牛奶中头孢噻呋的残留量,头孢噻呋测定结果为(64.8±5.8)μg·kg-1,置信区间为95%,包含因子k=2。通过不确定度评定可知,测定牛奶中头孢噻呋的不确定度主要是标准工作液配制、标准曲线校准样品浓度时引入。检测员可通过选用更高精度的量具来配制标准工作液,以及根据样品的预估进样浓度配制浓度合适的标准工作液,降低引入的不确定度,以提高检测数据的准确性。
参考文献
[1]中国兽药典委员会.中国兽药典[M].北京:化学工业出版,2005.
[2]白国涛,储晓刚,潘国卿,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中9种头孢菌素类药物残留[J].色谱,2009,27(4):417-420.
[3]陈号,彭开松,朱良强,等.动物源食品中β-内酰胺类药物残留分析方法的研究进展[J].中国兽药杂志,2008,42(5):42-45.
[4]国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.动物源性食品中头孢匹林、头孢噻呋残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法:GB/T 21314—2007[S].北京:中国标准出版社,2007.
[5]国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示:JJF 1059.1—2012[S].北京:中国标准出版社,2012.