黄曲霉毒素残留检测技术研究进展

作者: 王博

摘 要:黄曲霉毒素普遍存在于食品和饲料中,对人类和动物的健康和生理功能,如肝脏机能和代谢系统,具有明显的不良影响,为粮食和畜牧业带来巨大风险。因此,对黄曲霉毒素这类有害物质的准确检测显得尤为重要。本文梳理了当前的检测手段,对各种方法进行了对比评估,意在找到更高效、灵敏和准确的检测方法,以期为今后黄曲霉毒素残留检测技术的改良和创新提供支撑和借鉴。

关键词:黄曲霉毒素;检测技术;食品和饲料

Research Progress on Detection Techniques for Aflatoxin Residues

WANG Bo

(Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

Abstract: Aflatoxins are commonly present in food and feed, posing significant adverse effects on the health and physiological functions of humans and animals, notably impacting liver function and metabolic systems. This brings substantial risks to the grain and livestock industries. Therefore, accurate detection of harmful substances such as aflatoxins is particularly important. This article summarizes the current detection methods and compares and evaluates various methods, aiming to find more efficient, sensitive, and accurate detection methods, in order to provide support and reference for the improvement and innovation of aflatoxin residue detection technology in the future.

Keywords: aflatoxins; detection techniques; food and feed

黄曲霉毒素是一类由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的次生代谢产物。根据其化学结构和荧光特性,主要分为黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2,AFB2)、黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)以及黄曲霉毒素G2(Aflatoxin G2,AFG2)等。这些毒素普遍污染农产品及其副产品,当这些农产品被消费者食用时,会对健康造成严重危害,长期摄入含此类毒素的食物会增加肝癌风险,导致免疫抑制、生长障碍和营养不良。对于家畜,毒素的摄入极易导致生长缓慢甚至死亡。因此,为确保食品和饲料安全并推动畜牧业的可持续发展,对黄曲霉毒素进行有效检测成为一项至关重要的任务。

1 理化检测方法

黄曲霉毒素通常呈细小的结晶状或粉末状,在紫外光照射下可发出蓝绿色的荧光。其中黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素家族中最常见且毒性最强的亚型,其分子式为C17H12O6,AFB2、AFG1和AFG2与AFB1相似,但在结构上略有差异,其毒素的活性与多环结构及内部的双键密切相关。为检测此类化合物,常用的理化方法包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法和薄层层析法。

1.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是一种在分析化学领域广泛应用的分离和定量分析技术。该方法通过将混合物中的化合物分离为各自的组分,并在不同的保留时间内进行检测,从而实现高分辨率和灵敏度。胡滨等[1]使用Permaphase ETH色谱柱,以2-丙醇∶水(3∶97)作为洗脱液,以AFG1、AFB2、AFG2、AFB1的次序进行分离。在254 nm的波长下,吸收较强,检测限能够达到10-9。但是,HPLC法需要昂贵的仪器并且分析时间较长,不适用于快速、大批量的检测。

1.2 液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用技术(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer,LC-MS)将液相色谱(Liquid Chromatograph,LC)和质谱(Mass Spectrometer,MS)有效结合,综合LC的分离能力与MS的定性和定量特性,可以在复杂样品中的组分经LC分离后,迅速且准确地获取其质谱信息。林素琼等[2]利用此方法成功进行了燕窝中黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的快速检测,采用84%乙腈进行超声辅助提取(Ultrasonic-Assisted Extraction,UAE),免疫亲和固相萃取柱进行净化,在0.1~4.0 μg·L-1的相关系数>0.999,加标回收率为82.4%~107%。然而,某些化合物因其化学性质或与质谱的交互作用,应用LC-MS技术可能难以被检出,且对于LC-MS数据的解读,特别是在多重质谱模式下,需要专业的知识和经验。

1.3 薄层层析法

薄层层析法(Thin-Layer Chromatography,TLC)是一种分离技术,基于各成分对同一吸附剂吸附能力不同,样品组分会在不同的位置被分离。化合物的位置和浓度可以通过显色试剂或紫外光进行检测。杨焱等[3]使用TLC方法进行定量分析,发现AFB1在0.4~10.0 ng呈线性,且该方法的回收率高达98%。尽管如此,TLC法分析样品时还是需要进行复杂的预处理。因此,对于复杂的样品分析,TLC不是首选方法。

2 免疫学检测法

免疫学检测方法主要有酶联免疫吸附测定法、胶体金免疫层析法、免疫荧光法、免疫磁珠法等。

2.1 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)是一种灵敏度高、特异性强的生化分析技术。万宇平等[4]建立了AFB1间接竞争ELISA检测试剂盒,通过将AFB1与蛋白质载体牛血清蛋白和卵清白蛋白偶联制备了AFB1-BSA和AFB1-OVA偶联物,使用AFB1-BSA作为免疫原制备特异性抗体。该试剂盒的IC50为128.8 ng·L-1,检测线性范围为50~1 800 ng·L-1,检测限不超过100 ng·kg-1;食用油、花生和谷物的平均添加回收率大于71.3%。ELISA具有高特异性,且操作简便;然而,该方法易受到干扰物影响,且对样本处理要求较严格。

2.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法(Colloidal Gold Immunochromatography Assay,CGIA)作为一种生物化学分析技术,通常用于检测蛋白质或抗体。利用纳米颗粒的特性,将胶体金颗粒与特异性抗体或抗原标记结合,形成胶体金标记的复合物。复合物在试剂纸或薄膜上移动时,会与待测样品中的目标分子发生特异性结合,通过颜色变化可视化或仪器读数得到检测结果。徐振斌等[5]成功开发了一种胶体金免疫层析法,用于迅速准确地定量检测玉米中黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1和AFG2总量。该方法检出限低,同时表现出82.4%~95.8%的良好回收率。然而,其在定量和高精度要求的情况下,与特定抗体的特异性结合受到样品复杂性和干扰物质的影响,可能导致假阳性或假阴性结果。

2.3 免疫荧光法

免疫荧光(Immunofluorence Assay,IFA)法是一种用于生物分子检测的灵敏度高和特异性强的方法。其基本原理是将荧光标记的抗体或抗原与待测样品中的目标分子结合。复合物会发出荧光信号,光激发后,标记的分子会在特定波长范围内发射荧光,产生特征性的荧光光谱。苗银萍等[6]以荧光微球为标记物,结合2,4-二硝基苯酚独立质控体系和竞争法检测原理,成功构建了谷物中黄曲霉毒素AFB1的荧光免疫定量即时检测方法,该方法的关键条件包括使用pH值为7.8的硼酸盐缓冲液进行活化、pH值为7.5的磷酸缓冲液进行偶联,微球抗体质量比为5∶4,抗原抗体反应质量比为50∶1。试纸条的检出限为0.299~0.997 μg·kg-1,定量限为0.544~

2.663 μg·kg-1,虽然存在与黄曲霉毒素AFB2的交叉反应(6.1%),但与其他类似物无交叉反应(<0.1%)。免疫荧光法具有高灵敏度,可检测到极低浓度的物质,然而,其需要使用昂贵的荧光标记抗体,设备和仪器的维护成本也相对较高,因此在应用中需要考虑成本方面的因素。

2.4 免疫磁珠法

免疫磁珠法(Immuno-Magnetic Bead Assay,IMB)将具有特异性的抗体或抗原共价固定到磁性珠子表面,形成功能化的免疫磁珠,并将其与待测样品混合。在这个过程中,目标分子会与免疫磁珠上的抗体或抗原发生结合,通过施加外部磁场,可以将免疫磁珠与非特异性物质分离开,进行进一步分析或检测。谢芳等[7]建立了酱油中的免疫磁珠富集方法,该方法在0.05~0.30 μg·kg-1具有良好的线性关系(R2=0.984 2)。在酱油中添加0.5~7.0 μg·kg-1 黄曲霉毒素B1的平均加标回收率为83.6%~104.0%。不过,免疫磁珠法也存在一些潜在的局限性,在制备免疫磁珠时需要复杂的化学合成和功能化步骤,因此可能会增加成本和操作难度。

3 其他方法

3.1 噬菌体展示法

噬菌体展示法(Phage Display)是一种将外源肽或蛋白基因与噬菌体特定蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术。王妍入等[8]成功筛选出具有活性的纳米抗体Phage 2-5。使用Phage 2-5构建了酶联免疫分析体系,成功地筛选出了对黄曲霉素毒素具有高特异性和高亲和力的抗体。其在最优条件下,Phage 2-5的ELISA对黄曲霉毒素B1的IC50值为

0.054 ng·mL-1,对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为38.6%、70.1%、14.5%、14.6%,使用5%、10%、20%和40%甲醇浓度建立ELISA标准曲线,在浓度达到40%时不再反应,最高耐受甲醇浓度可达到20%。这种纳米抗原的建立,为进一步开发黄曲霉毒素抗原提供了有力的基础。

3.2 近红外光谱技术法

近红外光谱技术(Near Infrared Spectrum Instrument,NIRS)是一种用于分析物质成分和性质的非破坏性光谱学方法。其原理为当近红外光穿过样品时,被样品中的分子吸收或散射,形成光谱图。这些光谱信息可以通过数学建模和数据处理来解释,从而获得样品的化学和物理信息。严晨等[9]将花生放置8 d使其霉变,霉变期间动态采集光谱信息,并用酶联免疫吸附法测定花生中AFB1含量。对光谱数据进行多元散射校正、基线校正、标准正态变量校正和Savitzky-Golay平滑处理,确定了8个特征波长,对图像进行灰度化和阈值分割等处理,提取12种图像颜色特征参数,利用线性判别分析(Linear Discriminant Analysis,LDA)和支持向量机(Support Vector Machine,SVM)建立定性判别分析模型,以区分花生样品中的AFB1含量是否超过国家标准的限值(20 μg·kg-1)。其中基于全谱段的模型最佳识别率达到92%,基于特征波长的模型最佳识别率为88%。非线性SVM模型在根据图像颜色特征参数建模分析上表现较优,最佳识别率为90%。结合光谱和图像信息的融合SVM模型最佳识别率达到92%。NIR需要较少的样品制备步骤,在分析复杂混合物时非常突出,并且光谱对许多分子的吸收具有高灵敏度,可以检测低浓度的化合物。

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