食品中诺如病毒流行现状及其病毒分离方法的研究进展

摘 要：食品基质是食源性病毒传播的主要媒介，其中诺如病毒（Norovirus， NoV）的检测也备受国内外关注。食源性NoV暴发和污染给人类健康和食品安全造成了极大的威胁。而基于食品基质成分的复杂程度，其样本前处理过程一直是病毒检测研究中的重点和难点，直接影响NoV的精准检测和结果的可靠性，给食品安全监管及疫情防控带来困难。本文综述了NoV在食品中的流行现状，为食源性NoV的风险评估和监管预警提供基础性研究数据。在查阅文献的基础上，就食品中NoV的分离方法进行了全面论述，比较了各个方法的优缺点，旨在为完善和扩充食品中NoV检测基质范围提供方法，为研究简便、快捷、准确的食源性NoV检测方法提供参考和思路，以防范NoV造成的污染及感染事件发生。

关键词：食品;食源性;诺如病毒;检测方法;分离;洗脱;富集

Recent Progress in Prevalence and Virus Isolation Methods of Norovirus in Food

WANG Dianfu1， QI Xin2， YANG Yu2， WANG Xiao3， MA Lidan4*， YI Jiaying5

（1.Liaodong University， Dandong 118000， China; 2.Technology Centre of Dalian Customs District， Dalian 116000， China; 3.Dalian International Travel Healthcare Center， Dalian 116001， China; 4.Comprehensive Technical Service Center of Dandong Customs， Dandong 118000， China; 5.Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract： Food matrix is the main medium for the transmission of food-borne viruses， and the detection of norovirus （NoV） has also attracted much attention at home and abroad. Foodborne NoV outbreaks and contamination pose a great threat to human health and food safety. With the complexity of food matrix components， the sample pretreatment process has always been the focus and difficulty in virus detection research， which directly affects the accurate detection of NoV and the reliability of the results， and makes difficulties to food safety supervision and epidemic control. The prevalence of NoV in food is summarized， and provides research data for risk assessment and regulatory warning of food-borne NoV. Based on the literature review， the isolation methods of NoV in food are comprehensively discussed， and the advantages and disadvantages of each method are compared， to improve and expand NoV detection method of food matrix， and to provide reference and ideas for the study of simple， fast and accurate foodborne NoV detection methods， to prevent the contamination and infection of NoV.

Keywords： food; foodborne; norovirus; detection method; isolation; elution; enrichment

诺如病毒（Norovirus，NoV）具有传播速度快、传染性强等特点，在我国被列入丙类传染病，是造成全球病毒型急性胃肠炎及食源性疾病的主要病原体之一。据统计，73%～95%的急性胃肠炎疾病暴发均与其有关，给人们带来严重的疾病负担，甚至致人死亡，是威胁人们健康和破坏食品安全的公共卫生问题之一[1]。

NoV属于杯状病毒科诺如病毒属，根据衣壳蛋白（Virus particle 1，VP1）序列，分为10个基因组（Genogroup，GⅠ-GⅩ），共计48个基因型，其中GⅠ型和GⅡ型是引起人体急性胃肠炎的两个主要基因群，并且据相关监测数据表明NoV GⅡ.4型为人群最普遍的感染源[2-4]。其传播途径主要包括3种，即经食源性传播、经水源性传播和人-人传播。其中食源性传播主要因食物在生产、运输等过程中遭受污染造成，其极高的感染概率已超过现报道的任何一种食源性病毒[5]。因此，对于生食、未彻底加工或冷冻的食品更易受到NoV污染并引发食源性病毒疾病。

本文对食源性NoV在食品中的流行现状进行了调查，同时对食品中食源性NoV的主要分离方法进行了综述，了解近年NoV分离方法的研究进展，为防范食源性NoV疾病的暴发提供预警和参考依据，以期为提高食源性病毒检出率提供参考。

1 NoV有关的流行概况

NoV的暴发具有明显的季节性，多在秋冬季高发[6]。在我国通过食品媒介造成污染及潜在危害的事例屡见不鲜。2020年6月至2021年5月期间，对广州市售牡蛎进行消费风险评估发现，牡蛎中NoV阳性检出率为52.7%（58/110），存在较高水平NoV污染风险[7]。时沙沙等[8]对枸杞岛养殖场670只贻贝样本中NoV污染情况进行了解，检测NoV阳性率达9.9%（66/670），得出离人类活动区域较近贻贝样品中NoV阳性率是远岸贻贝样品NoV阳性率3倍的结论，表明人类活动对养殖场内贻贝中NoV的富集量具有一定影响。而据国外报道，在2016—2018年和2020年期间对阿根廷栽培的8种软果进行检测研究，NoV检测率为0.5%（1/184）[9]。SARMENTO等[10]对巴西某一沿海城市贝类产品中NoV进行检测和鉴定，Nov检出率为41.5%（32/77），以GII最为普遍，检出率为37.7%（29/77），揭示了人类活动都受海洋环境的影响，呼吁在贝类养殖区进行NoV的监测工作，为防止食源性疾病的暴发提供预警。可见近几年由食源性NoV引发的急性胃肠炎疾病在国内外一直处于流行状态，并严重影响人们的健康。

欧盟食品与饲料快速预警系统（rapid alert system for food and feed，RASFF）[11]作为食品领域重要的信息交流平台，其通报严重影响被通报国的产品销售，也给各企业带来名誉和经济上的双重损失。以RASFF成员国和非成员国涉及的食源性NoV通报数进行统计（图1），发现食源性NoV一直处于暴发阶段，十年内通报数达289条，尤其在2013年、2014年、2018年和2020年较为严重。食源性NoV在食品中的分布情况如图2所示，2011年至2021年食品中造成NoV污染的种类主要以贝类为主，牡蛎更是造成病毒污染的主要来源，各种软质水果均有造成食源性NoV暴发的可能，也被列入常见的污染源头。

根据美国疾病与预防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的统计数据[12]，2011年至2020年间，食品中水产品、软质水果和蔬菜引起的食源性NoV暴发涉及美国39个洲，共计暴发了277次，6 583人次患病，导致62人住院治疗，3人死亡。2021年报告NoV季节暴发数量要低于前8年同季节暴发数量。虽暴发数量呈下降趋势，但在高风险食品媒介中仍存在病毒感染的风险。

2 食源性NoV的检测方法概况

食源性NoV常常在食品和水中被检出。食品中NoV的感染途径主要包括3种，即海产品中贝类被感染，新鲜的产品在收获、生产或包装的过程中被污染以及即食食品在制备加工过程中被污染。目前，国际上针对NoV检测的通用标准为ISO 15216—2：2019，标准检测方法适用于软果蔬菜、硬质食品表面、瓶装水和贝类，同时该标准中对超出此适用范围的检测也进行了说明，需要试验人员验证方法的有效性。而我国针对食源性NoV检测方法主要分为两类，一类为采用实时荧光PT-PCR法的定性检测，包括食品安全国家标准GB 4789.42—2016和行业标准SN/T 4784—2017，除国标中不涵盖瓶装水检测范围，其他基质范围均与国际标准相一致;另一类为定量检测，包括行业标准SN/T 5325.1—2020，适用范围为贝类、硬质表面食品、生食蔬菜和软质水果。从各种检测方法可以看出，Nov的检测会因各种食品基质所含复杂成分不同而存在大量RT-PCR抑制剂，影响核酸提取效率，同时NoV在食品中往往以低拷贝状态存在并可致病，因此食品基质的洗脱和富集过程对病毒的准确检出尤为重要，直接影响结果的准确性。

3 食品中NoV的洗脱和富集

随着世界贸易的发展，食品产品开始多样化，存在的污染风险也越来越多，不仅贝类、软质水果和蔬菜等食品中检出Nov，在其他即食、脂肪蛋白质类等食品中也能检出NoV。目前，针对食源性NoV核酸提取和扩增技术已经较为成熟，而由于食品中各种样品基质成分复杂，NoV的分离方法还处于不断摸索和研究阶段。因此，病毒的洗脱和富集过程成为提高NoV检出率的关键。不同食品中NoV分离方法的比较见表1。

3.1 病毒的洗脱

食品中的NoV不能在体外常规培养且含量低，需将食品中的病毒粒子转移至不同种类的洗脱液中再进行病毒的富集浓缩过程。洗脱液中的pH值对洗脱效果有一定影响，通常在碱性条件下（pH值为9.0～10.5），病毒粒子和食品表面的结合能力要弱于酸性环境，带负电的病毒粒子可与氨基酸吸附，将病毒粒子与食品分开，完成病毒粒子的洗脱过程。

现常用洗脱液分有机和无机两种。有机洗脱液中Tris-甘氨酸-牛肉浸提物洗脱液（Tris-glycine-beef extract，TGBE）和胰蛋白胨磷酸酶洗脱液（Tryptose phosphate broth，TPB）较为常见。TGBE是一种使用最为广泛的洗脱液，也是国际标准ISO 15216—2中建议采用的洗脱液;TPB洗脱液为加拿大健康中心推荐使用的洗液。磷酸盐类、碳酸盐类和氢氧化钠洗脱液则为常见的无机洗脱液。王宏等[13]和王飞等[14]分别采用不同的洗脱液洗脱酸性水果表面的病毒粒子时均发现，TGBE洗脱液得到病毒粒子洗脱率最高、缓冲能力最好，分析原因不是由于洗脱液不同，而是不同洗脱液之间pH值存在较大区别，造成洗脱效果不同，pH值偏碱性的洗脱液更适合于酸性水果的洗脱过程。阮佳等[15]考察了不同pH值条件下，甘氨酸洗脱液对莴苣中NoV洗脱效果的影响，结果表明甘氨酸洗脱pH值不同，NoV回收率不同，当采用pH值 5.0的甘氨酸洗脱液洗脱时病毒回收率最高。由此可见，pH值在病毒粒子洗脱效果中起重要作用，直接影响NoV的检测结果。