液质联用法测定香肠中氯霉素的不确定度评定
作者: 刘叶 孙爱玲
摘 要:本文采用高效液相色谱-质谱法对香肠中的氯霉素含量进行了测试,为进一步证明该测量方法结果的准确性和科学性,建立了相应的数学模型对氯霉素含量测试的不确定度进行考察评定。通过分析测量过程中产生的不确定度,计算相对合成不确定度和扩展不确定度,得到了香肠中氯霉素测定结果的不确定度报告。结果显示,该方法测得香肠中氯霉素残留量为
0.98 μg·kg-1,扩展不确定度为0.17 μg·kg-1。其中,影响不确定度的重点因素主要为标准储备液、中间液和标准曲线测试液的配制、标准曲线的拟合和仪器校准。
关键词:不确定度;液相色谱-串联质谱;氯霉素;香肠
Evaluation of Uncertainty in the Determination of Chloramphenicol in Sausage by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Method
LIU Ye, SUN Ailing
(Yi Nuo (Tianjin) Testing Service Co., Ltd., Tianjin 300383, China)
Abstract: In this paper, the chloramphenicol content in sausage was measured by high performance liquid chromatography-mass spectrometry, in order to further prove the accuracy and scientificity of the measurement method, a corresponding mathematical model was established to evaluate the uncertainty of chloramphenicol content test. The uncertainty report of chloramphenicol determination in sausage was obtained by analyzing the uncertainty generated in the measurement process, calculating the relative synthetic uncertainty and the extended uncertainty. The results showed that the chloramphenicol residue in sausage was 0.98 μg·kg-1, the expanded uncertainty is 0.17 μg ·kg-1. Among them, the key factors affecting the uncertainty are mainly the preparation of standard stock solution, intermediate solution and standard curve test solution, the fitting of standard curve and the calibration of instrument.
Keywords: uncertainty; high performance liquid chromatography-mass spectrometry; chloramphenicol; sausage
氯霉素[1-2]作为一种典型的抗生素,在畜牧业、水产养殖、家禽饲养等行业得到了广泛应用。但氯霉素具有一定的毒性,会对人们的血液系统造成损害,甚至有可能引起再生障碍性贫血,且该症状是不可逆的。因此,氯霉素的毒副作用引起了人们的重视,如何减少氯霉素的使用频率也成为了热点话题。为了减少该药品的滥用对于人们造成的伤害,国家相关部门于2002年发布农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》,对该药品的使用进行了严格的规定,氯霉素及其相关化学品被禁止在食用动物上使用。随后,发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单(第五批)》(整顿办函〔2011〕1号)明确规定肉制品中不得检出氯霉素。
测量不确定度是一个非负参数[3-10],用来表明实验中测量的结果之间所存在的分散性。此外,由于检测实验中会出现一定的测量误差,不确定度的测定有助于提高检测结果的准确性和可信度。本文结合相关资料[11-15],依据《测量不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)、《常用玻璃量器》
(JJG 196—2006)、《化学分析中不确定度的评定指南》(CNAS—GL006:2019)等相关文件对液质联用法测定香肠中氯霉素的不确定度进行了评定。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Thermo Fisher TSQ Quantis 液相色谱-质谱仪:配电喷雾离子源;ME 204分析天平;JW-2022HR冷冻离心机;XW-80A混合仪、HSC 24 B氮吹仪。
氯霉素标准品,纯度≥99.24%;氘代氯霉素内标;乙腈,HPLC级;无水硫酸钠、无水氯化钠,分析纯;HyperSep Retain-PEP SPE 柱;0.45 μm有机相滤膜;实验室一级水。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
称取50 mg氯霉素于100 mL容量瓶中,缓慢加入乙腈溶液并定容,得到氯霉素标准储备液
(500 μg·mL-1)。然后于10 mL容量瓶中加入20 μL
标准储备液并使用乙腈定容,得到标准中间液
(1 μg·mL-1)。使用移液枪抽取5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和500 μL标准工作液于提前准备好的5支不同容量瓶(10 mL)中,并在其中均加入1 mL氘代氯霉素作为内标工作液,定容,得到一系列氯霉素浓度为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的标准溶液,其中氘代氯霉素的浓度为10 ng·mL-1。
1.2.2 测定方法
称5 g绞碎均质的香肠样品于50 mL离心管中,加内标液100 μL,加入3 mL水和一粒陶瓷均质子,混匀,加入乙腈 5 mL,涡旋并置于冷冻离心机中
10 000 r·min-1离心5 min,将上清液倒入另一50 mL离心管,在残渣中再加入ACN 5 mL,重复提取一次,两次上清液倒入同一离心管,随后加入4 g Na2SO4和1 g NaCl,涡旋,8 000 r·min -1离心5 min。活化萃取柱,将离心后的溶液转移至固相萃取柱,收集流出液。40 ℃的条件下,氮气吹干,1 mL水定容,过0.45 μm膜测定。
1.3 不确定度模型
不确定度数学模型为
(1)
式中:X为试样中待测组分残留量,μg·kg-1;C为样液中待测物的浓度,ng·mL-1;V为试样定容体积,mL;m为样品称样量,g。
2 结果与分析
2.1 不确定度来源分析
从测定过程和确定的数学模型进行分析,氯霉素测定不确定度的来源有以下8方面:①氯霉素标准储备液和中间液配制产生的不确定度;②容量瓶引入的不确定度;③移液枪引入的不确定度;④标准工作曲线拟合产生的不确定度;⑤样品称量产生的不确定度;⑥样品定容体积产生的不确定度;⑦样品重复测定引起的不确定度;⑧液质联用仪引起的不确定度。
2.2 浓度C引入的不确定度urel(C)
2.2.1 重复性引起的不确定度urel(C1)
对样品中的氯霉素含量进行重复测定,测定结果见表1。其标准偏差为S=,重复测定产生的标准不确定度为u(C1)=0.026 4 ng·mL-1,相对标准不确定度为:。
2.2.2 标准物质引入的不确定度urel(C2)
(1)氯霉素标准储备液和中间液配制产生的不确定度urel(C2标)。将50 mg标准品用色谱纯乙腈溶于100 mL容量瓶中,随后定容。氯霉素的纯度为(99.23±0.77)%,其中k=2。因此,由纯度的微小变化所引入的相对不确定度为。
根据检定证书的内容可知,实验所用型号的天平允许误差通常是±0.5 mg,按均匀分布,则由称量准确度引入的标准不确定度和相对不确定度分别为=0.288 7 mg,
。
100 mL容量瓶定容引入的不确定度:100 mL容量瓶的误差范围是0.1 mL,按矩形分布,其标准不确定度为u(V100)=0.057 7 mL。室内温度为(20±5)℃,而由温度波动引起的体积变化通常是呈均匀分布的,k=
,乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3,由此可得到温度波动引入的标准不确定度为u(V100t)=0.395 mL。则100 mL容量瓶定容引入的相对不确定度为
10 mL容量瓶定容体积引入的不确定度:根据计量书所提供的数据,10 mL容量瓶体积变化的允许误差为±0.020 mL。按照矩形分布来计算相对不确定度,则为urel(V10)=0.001 2。由实验室内温度变化所导致容量瓶体积变化如上文所述,同理可得出温度引起的相对不确定度为urel(V10t)=0.003 95。则10 mL容量瓶定容体积引入的相对不确定度为
1 000 μL移液枪移取1 000 μL溶液时产生的容量允许误差为±1%,按矩形分布,k=,
则移液枪移取体积所引入的相对不确定度为。
因此,合成氯霉素标准储备液和中间液配制产生的相对不确定度为
(2)标准曲线配制过程产生的不确定度。①容量瓶引入的不确定度urel(V容):容量瓶允许误差是±0.020 mL,按矩形分布,相对不确定度为。
温度波动通常也会导致物体的体积产生一些细微的变化,进而影响测试的最终结果。本实验室内温度是(20±5)℃,k=,体积膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1,因此温度波动引入的相对不确定度为。
10 mL容量瓶引入的相对不确定度为。
②移液枪引入的不确定度urel(V器):不同移液枪的不同量程,其允许的最大误差不同。即便是同样容量的移液枪,在量取不同体积溶液时也往往会出现不同的允许误差。例如,10 μL移液枪的允许误差为±8%;50 μL移液枪移取5 μL溶液时产生的误差为±8%、取50 μL时为±3%;1 000 μL移液枪取
100 μL溶液时产生的误差为±2%、取500 μL时为±l%。按矩形分布,k=,可得到不同移液枪引入的相对不确定度为
(2)
式中:Vi为不同移液体积,μL;ti为容量允差误差;V器为移液枪规格,μL。
各相应移液体积的容量允许误差及相对不确定度见表2。
2.2.3 标准工作曲线拟合产生的不确定度urel(CX)
氯霉素标准溶液的测定结果如表3所示,拟合可得Y=0.103 4X−0.008 157。
(3)
(4)
则标准工作曲线拟合产生的相对不确定度为
式中:S(Y)为标准曲线的标准差;P为样品溶液的测定次数,P=10;N为标准溶液的测定次数,N=5;a为标准曲线的截距;b为标准曲线的斜率;Cx为样品溶液中待测物的浓度,ng·mL-1;c为标准溶液浓度的平均值,ng·mL-1;ci为校准标准溶液的浓度;Yi为单次标准溶液的响应值。