布氏乳杆菌L34-2对黄曲霉毒素脱毒条件优化

摘 要：本研究以甘肃地区酸菜中分离的一株黄曲霉毒素B1脱毒率高达66.4%的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）L34-2为材料，以菌株对AFB1脱毒条件及脱毒机制为研究内容。结果表明，脱毒最佳反应条件为发酵温度30 ℃，发酵液pH值4.0，接种比例50 mL/300 mL，氧气供应量60%，优化后菌株L34-2脱毒率达到85.7%，比优化前提高21.1%，影响脱毒效果最大的因素是发酵温度。

关键词：黄曲霉毒素B1;布氏乳杆菌;西北酸菜;脱毒条件优化;解毒机制

Optimization of Detoxification Conditions of AFB1 by Lactobacillus buchneri L34-2

WANG Junli1， CHEN Chunxi2， DENG Zhanrui1

（1.Gansu Province Product Quality Supervision and Inspection， Lanzhou 730050， China; 2.Lanzhou Jiaotong University， Lanzhou 730070， China）

Abstract： In this study， Lactobacillus buchneri L34-2， a strain of aflatoxin B1 with a detoxification rate of 66.4% isolated from sauerkraut in Gansu， was used as the material to study the detoxification conditions and detoxification mechanism of AFB1 by the strain. The results showed that the best reaction conditions for detoxification were fermentation temperature 30 ℃， pH 4.0 of fermentation broth， inoculum ratio 50 mL/300 mL， and oxygen supply 60%， and the detoxification rate of strain L34-2 reached 85.7% after optimization， which was 21.1% higher than that before optimization， and the factor that affected the detoxification effect most was fermentation temperature.

Keywords： aflatoxin B1; Lactobacillus buchneri; pickled vegetable in northwest china; detoxification condition optimization; detoxification mechanism

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一类强致癌、致畸形的真菌毒素，它主要是黄曲霉（A.flavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）次级代谢产生的二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，其致癌特性的来源是香豆素结构，毒性来源是二氢呋喃环结构[1]。已分离鉴定的黄曲霉毒素有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等18种，其中黄曲霉毒素B1（ Aflatoxin B1，

AFB1）是已发现的AFT中毒性及致癌性最强的，1993年国际癌症研究机构（IARC）将AFB1划分为I类致癌物[2]。AFB1对肝脏及免疫系统有强抑制性，对人畜有很强的致癌、致突变、致畸性[3-4]。

目前，食品中常用的AFB1脱毒方法有物理法、化学法、生物法及基因干预4种方法。生物法去除AFB1效率最高、特异性最强、污染最小[5]。生物利用本身特异性结构或代谢产物吸附、修饰、破坏AFB1毒性分子结构，达到脱毒的效果[6-7]。本研究团队从35份采集自甘肃省不同地域的西北酸菜样品中筛选到一株AFB1吸附率高达66.4%的布氏乳杆菌L34-2，该菌株解吸后仍保留53.7%的吸附率。本研究通过正交试验优化菌株L34-2的脱毒条件，提高菌株吸附率、稳定性，同时对脱毒机理进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源

研究团队从西北酸菜中分离筛选到一株布式乳杆菌（Lactobacillus buchneri）L34-2，菌株L34-2优化前AFB1脱毒率为66.4%。

1.1.2 试剂

（1）基础培养基。MRS培养基（CM188）、莫匹罗星锂盐（P-109）、半胱氨酸盐酸盐（P-03）、MC培养基（CM156）、磷酸盐缓冲液（CM1022）、营养琼脂（CM107）、马铃薯葡萄糖琼脂（CM123）、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（CM123A）、缓冲蛋白胨水（CM201），以上培养基均由北京陆桥提供。

（2）HPLC-MS/MS试剂。二氯甲烷（色谱纯，sigma）;甲醇（色谱纯，sigma）;乙腈（色谱纯，sigma）;苯（色谱纯，sigma）。

（3）酶类。鸡卵白自溶酶（Sigma，USA）;蛋白酶（Sigma，USA）。

1.2 仪器设备

1300 SERLES A2-1379型生物安全柜，赛默白世尔（苏州）仪器有限公司;QTRAP 4500超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱联用仪，SCIEX;16-09405恒温鼓风干燥箱，BINDER。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理方法

发酵液经12 000 r·min-1离心15 min分离，上清液经0.22 μm滤膜过滤后过免疫亲和柱，用超纯水洗滤2遍，然后用甲醇（色谱纯）洗脱，收集洗脱液。

1.3.2 超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱联用仪条件

液相色谱：色谱柱（C18柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱箱温度：40 ℃;流动相（乙酸铵/甲醇）;质谱条件：电离方式：电喷雾电离（ESI+）;检测方式：多反应监测模式（MRM）;气帘气（CUR）：35 psi;碰撞气（CAD）：medium;离子化电压（IS）：5 500 V;离子源温度：550 ℃;喷雾气（GSI）：55 psi;辅助加热器（GS2）：60 psi[8]。

1.4 单因素对菌株脱毒效率的影响

1.4.1 发酵温度对AFB1脱毒率的影响

参考WANG等[9]研究温度对AFB1生物脱毒率的影响，制备109 CFU·mL-1菌悬液，氧气供应量100%，以30 mL/300 mL比例接种于AFB1浓度为10 ng·mL-1的发酵液中，发酵温度分别为25 ℃、28 ℃、30 ℃、34 ℃、36 ℃和40 ℃，200 r·min-1振荡培养，研究发酵温度对菌株AFB1脱毒率的影响，得到适宜菌株脱毒的温度范围。

1.4.2 相同浓度菌悬液不同比例接种对AFB1脱毒率的影响

制备109 CFU·mL-1菌悬液，氧气供应量100%，发酵温度为36 ℃，不同比例接种，分别为0 mL/300 mL、40 mL/300 mL、50 mL/300 mL、60 mL/300 mL和75 mL/300 mL，200 r·min-1振荡培养，研究接种比例对AFB1脱毒率的影响，得到菌株最适宜的接种比例范围。

1.4.3 氧气浓度对AFB1脱毒率的影响

制备109 CFU·mL-1菌悬液，发酵温度为36℃，接种比例为30 mL/300 mL，在培养过程中控制氧气的浓度为0%、20%、50%、75%和100%，测定氧气浓度对菌株AFB1脱毒率的影响，得到菌株发酵最佳氧气供应量范围。

1.4.4 发酵液pH值对AFB1脱毒率的影响。

结合SHU等[10]的研究发现pH值对AFB1生物脱毒率有影响，制备109 CFU·mL-1菌悬液，发酵温度为36 ℃，接种比例为30 mL/300 mL，氧气供应量为100%，控制发酵液pH值分别为4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，研究发酵液pH值对菌株AFB1脱毒率的影响，优化菌株发酵液pH值。

1.5 菌株脱毒发酵条件优化

根据单因素实验结果筛选影响菌株脱毒率的因素范围，利用minitab软件设计L9（34）正交实验，从发酵温度、接种量比例、氧气浓度和发酵液pH值4个因素优化发酵培养条件，以菌株脱毒率为统计量，对结果进行统计学极差分析，得到菌株小规模发酵脱毒最优条件，提高菌株脱毒能力。各因素正交实验设计见表1。

1.6 数据统计分析

实验重复3次，结果采用Excel及minitab软件中数据分析进行统计学分析，数据间的显著性差异分析采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素发酵条件对L34-2菌株AFB1脱毒率的影响

2.1.1 发酵温度对L34-2菌株AFB1脱毒率的影响

发酵温度影响菌体的生长，单因素发酵条件选择培养温度在25～40 ℃，筛选菌株适宜的生长温度范围，提高菌株AFB1脱毒能力，菌株在30 ℃培养时，菌体生长量最高，AFB1脱毒能力较未优化活菌有较高增加，脱毒率为76.1%，如图1，将发酵温度列为正交实验影响因素。

2.1.2 接种比例对AFB1脱毒率的影响

单因素发酵条件选择接种比例在30 mL/300 mL～75 mL/300 mL，如图2，接种量为50 mL/300 mL，菌株接种发酵48 h，AFB1脱毒效率提高为77.6%，75 mL/300 mL接种量过于密集，菌株对AFB1的脱毒率不是随着接种量增加而增强。通过接种量的比较，选择能提高菌株脱毒率的接种比例为正交实验考虑的因素水平。

2.1.3 不同氧气浓度对菌株AFB1脱毒率的影响

根据研究布氏乳杆菌为兼性厌氧菌，如图3，单因素发酵条件选择氧气浓度0%～100%，筛选L34-2菌株发酵脱毒时最适宜氧气供应量。氧气供应量在50%时，菌株L34-2 AFB1脱毒率提高为78.4%。将氧气供应量作为正交试验的参考因素。

2.1.4 发酵液pH对菌株L34-2 AFB1脱毒率的影响

单因素发酵条件选择发酵液pH值4.5～8.5，如图4，筛选L34-2菌株脱毒率大幅提高的发酵液pH值范围。发酵液pH值在4.5时，菌株L34-2 AFB1脱毒率最高为80.5%，菌株L34-2生长及AFB1脱毒适宜pH值低的环境，将发酵液pH值作为正交试验考虑因素。

2.2 正交试验菌株脱毒发酵条件优化

根据单因素实验选择对菌株脱毒率有较大提高的发酵温度、接种比例、氧气供应量和发酵pH值，设计4因素3水平的正交试验，选择菌株脱毒最适宜的条件。由表2知，菌株L34-2脱毒过程中影响AFB1脱毒率的单因素顺序为发酵温度（4.03）>发酵液pH值（3.83）>接种比例（3.57）>氧气供应量（2.23）。结合各因素水平作用效果分析，选择优化后的菌株L34-2发酵脱毒条件为发酵温度30 ℃，控制发酵液pH值4.0，接种比例为50 mL/300 mL，氧气供应量60%，优化条件后，菌株L34-2脱毒率为87.5%，比优化前提高21.1%脱毒率。