高效液相色谱法测定番茄酱中11种工业染料

作者: 鞠光秀 吕晓静 刘畅 杨超 曲欣

高效液相色谱法测定番茄酱中11种工业染料0

摘 要:目的:建立高效液相色谱同时测定番茄酱中11种非法添加工业染料的方法。方法:样品经乙腈(含0.5%乙酸)和乙腈-水(1∶1,V/V)溶液分别超声提取,以ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)进行分离,0.02 mol·L-1乙酸铵-0.1%乙酸和乙腈为流动相梯度洗脱,DAD检测器检测,外标法定量。结果:目标化合物在0.5~10.0 μg·mL-1线性关系良好,检出限为0.08~0.35 mg·kg-1,加标回收率为80.6%~97.6%。结论:该方法简单、快速、灵敏、准确,适用于番茄酱中工业染料的检测。

关键词:工业染料;番茄酱;高效液相色谱法

Determination of Eleven Industrial Dyes in Ketchup by High Performance Liquid Chromatography

JU Guangxiu1, LV Xiaojing1, LIU Chang2, YANG Chao1, QU Xin1*

(1.Qingdao Municipal Center For Disease Control & Prevention/Qingdao Institute of Preventive Medicine, Qingdao 266033, China; 2.Shandong Quality and Technical Examination Assessment Center Co., Ltd., Jinan 250014, China)

Abstract: Objective: A method for simultaneous determination of 11 illegally added industrial dyes in ketchup by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. Method: The analytes in samples were extracted ultrasonically with acetonitrile (containing 0.5% acetic acid) and acetonitrile-water (1∶1, V/V). The analytes were separated with a ZORBAX SB-C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), and eluted with 0.02 mol·L-1 ammonium acetate-0.1% acetic acid and acetonitrile as mobile phase in gradient mode. The detection was performed with a DAD detector and the quantifications were based on external standard method. Result: The calibration curves showed good linearity within 0.5~10.0 μg·mL-1. The detection limits of the method were within 0.08~0.35 mg·kg-1, and the average recoveries ranged from 80.6% to 97.6%. Conclusion: The method is simple, rapid, sensitive and accurate, and is suitable for routine determination of industrial dyes in ketchup.

Keywords: industrial dyes; ketchup; high performance liquid chromatography

合成着色剂也称为合成色素,是食品加工中重要的一类食品添加剂,《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760—2014)[1]规定,食品中允许使用的合成着色剂只有日落黄等11种,除此以外,都禁止添加到食品中[2]。工业染料着色力强且价格低廉,常有不法商贩将其非法添加到食品中以谋取不正当利益。工业染料长期使用会产生致敏、致畸或致癌作用[3]。

目前,检测食品中禁用工业染料的方法主要有超高效液相色谱-串联质谱法(Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)[4-5]和高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)[6-7]。UPLC-MS/MS灵敏度高、分辨率好,但仪器价格昂贵;HPLC使用普遍,具有成本低、灵敏度高等优点。番茄酱的工业染料污染备受关注。本研究以违法添加较多的11种工业染料为检测对象,通过前处理方法及液相色谱条件的优化,建立了同时检测番茄酱中11种工业染料(红2G、酸性橙Ⅱ、碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、罗丹明B、对位红和苏丹红Ⅰ~Ⅳ)的高效液相色谱方法。

1 材料与方法

1.1 设备与试剂

设备:1260Ⅱ高效液相色谱仪,配DAD检测器(安捷伦公司);N-EVAP 112氮吹仪(Organomation公司);Heraeus Megafuge 8R高速冷冻离心机(Thermo Fisher公司);KQ5200DB超声波清洗器(昆山市超声仪器)。

试剂:酸性橙Ⅱ为AccuStandard产品;红2G、罗丹明B、对位红均为Dr. Ehrenstorfer GmbH产品;苏丹红Ⅰ~Ⅳ均为First Standard产品;碱性橙2、碱性橙21和碱性橙22均为CNW产品。甲醇、乙腈、乙酸铵、乙酸均为色谱纯;氨水为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

用乙腈溶解并配制浓度为10 μg·mL-1的11种工业染料混合标准溶液。移取适量上述混合标准溶液,用乙腈-水(1∶1,V/V)溶液稀释成浓度为0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1和10 μg·mL-1系列标准溶液。

1.2.2 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;进样体积:10 μL;流动相:A 0.02 mol·L-1乙酸铵-0.1%乙酸水溶液,B 乙腈;检测波长:450 nm、485 nm和520 nm;梯度洗脱程序见表1。

1.2.3 样品前处理

称取均匀的番茄酱样品5 g于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈(含0.5%乙酸),涡旋混匀1 min、超声提取10 min,5 000 r·min-1离心5 min获取上清液并置于另一离心管中,再次加入10 mL乙腈-水(1∶1,V/V)溶液重复提取一次,合并两次提取液,移取5 mL提取液40 ℃水浴下氮吹至近干,使用乙腈-水(1∶1,V/V)溶液定容至2 mL,过0.22 μm滤膜上机。

1.2.4 试验优化

(1)色谱条件中检测波长的优化。采用DAD检测器,分别采集每种化合物的最大吸收波长,综合采集到的波长数据,对最大吸收波长相近的化合物采用同一波长进行检测。

(2)前处理方法中提取溶剂的选择优化。提取溶剂的选择对实验的成败至关重要,实验中综合分析各个化合物的理化性质,兼顾提取效率和实验成本,选取对目标化合物溶解性较好的溶剂,并考察了不同组合溶剂的提取效果。

2 结果与分析

2.1 色谱条件中检测波长的优化

11种化合物都有较强的紫外-可见光吸收,最大吸收波长在410~550 nm。兼顾灵敏度的前提下,最大吸收波长相近的化合物选择了同一波长。450 nm波长下检测碱性橙2,485 nm波长下检测酸性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22、对位红和苏丹红I~Ⅱ,520 nm波长下检测红2G、罗丹明B、苏丹红Ⅲ~Ⅳ。标准色谱图如图1所示。

1-红2G;2-酸性橙Ⅱ;3-碱性橙2;4-碱性橙21;5-罗丹明B;6-对位红;7-苏丹红I;8-碱性橙22;9-苏丹红Ⅱ;10-苏丹红Ⅲ;11-苏丹红Ⅳ。

2.2 前处理方法中提取溶剂的选择优化

2.2.1 提取溶剂

工业染料常用的提取溶剂有水、甲醇、乙腈、丙酮和混合溶液等。11种化合物中,红2G水溶性强,酸性橙Ⅱ、罗丹明B、碱性橙2、碱性橙21和碱性橙22在水和有机溶剂中都有一定的溶解性,对位红和苏丹红染料都不溶于水而易溶于有机溶剂。实验中考察了多种溶剂分别在提取溶剂用量为10 mL、20 mL、30 mL条件下的提取效率。提取溶剂用量为20 mL时,不同提取溶剂各化合物的回收率见表2(超声时间为20 min)。结果表明,乙腈(含0.5%乙酸)比甲醇、纯乙腈具有更高的提取效率,除红2G和酸性橙Ⅱ外,其他染料的回收率达到75%以上。选用乙腈-水(1∶1,V/V)进行二次提取,红2G和酸性橙Ⅱ的回收率明显提高。故选择10 mL乙腈(含0.5%乙酸)和10 mL乙腈-水(1∶1,V/V)各提取一次,经过两次提取,回收率在85%以上。

2.2.2 溶剂用量

固定提取溶剂为乙腈(含0.5%乙酸)和乙腈-水,考察了不同溶剂用量(5 mL+5 mL、7.5 mL+7.5 mL、10 mL+10 mL、12.5 mL+12.5 mL、15 mL+15 mL、20 mL+20 mL)对11种染料回收率的影响。用量为5 mL+5 mL时,部分化合物的回收率小于50%,表明此用量不能将相应化合物完全提取出来;用量为7.5 mL+7.5 mL时,所有染料回收率明显提高,达到80%以上;用量为15 mL+15 mL和20 mL+20 mL时,个别染料的回收率稍有提高,但是增加溶剂用量对回收率贡献较小。故选择提取溶剂为10 mL乙腈(含0.5%乙酸)和10 mL乙腈-水,两次提取。

2.2.3 超声时长

实验中考察了单次超声时长(5 min、10 min、15 min、20 min)对11种染料回收率的影响。结果表明,除单次超声5 min大部分染料的回收率小于80%外,其他超声时长下,所有11种染料的回收率皆大于80%,但是延长超声时长对回收率贡献较小,故乙腈(含0.5%乙酸)和乙腈-水用量都为10 mL,每次超声时长为10 min。

2.3 方法线性和检出限

以目标化合物的峰面积对其质量浓度进行线性回归,发现11种工业染料在1.2.2所述色谱条件下分离效果良好,线性范围为0.5~10.0 μg·mL-1,相关系数在0.999以上。红2G、酸性橙Ⅱ、碱性橙2、碱性橙21、罗丹明B、对位红、碱性橙22和苏丹红Ⅰ~Ⅳ的线性方程分别为y=13.08x-0.060、y=5.672x+0.001、y=19.58x+0.123、y=29.84x-0.328、y=42.61x-5.402、y=21.99x+0.345、y=22.23x-1.342、y=42.28x-0.683、y=45.45x-3.065、y=40.78x+3.174、y=20.65x+1.331,通过配制一系列低浓度的标准溶液,依据3倍信噪比计算其检出限,检出限分别为0.25 mg·kg-1、0.35 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.15 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1和0.20 mg·kg-1。信噪比为10时的浓度为定量限。

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