婴幼儿配方食品中肌醇含量的检测方法研究

摘 要：为进一步规范食品安全监督抽检工作，肌醇项目的测定被纳入婴幼儿配方食品中的抽检项目，且依据GB 5009.270—2016第二法气相色谱法所制定的检测方法，考虑化合物衍生化过程对水分控制较为严格，其样品前处理过程实验时间长且步骤烦琐。实验对前处理过程进行了方法优化，改变了干燥方法，增加了净化步骤，使得上述问题得到了显著改善，解决了以往的技术难题，提高了肌醇测定的工作效率，能够为检验机构和食品生产、检验工作提供参考。

关键词：婴幼儿配方食品；肌醇；检测方法；食品安全

Study on the Determination Method of Inositol in Infant Formula Food

CHEN Yuzhong， TAN Jinping*， QI Ping， ZHOU Qingqiong， CHEN Ting， HUANG Xiaoqing

（Guangzhou Institute for Food Inspection， Guangzhou 511410， China）

Abstract： In order to further standardize the sampling inspection of food safety supervision， the determination of inositol is included in the sampling inspection of infant formula food. In accordance with the detection method developed by the second method of gas chromatography （GB 5009.270—2016）， the compound derivatization process has strict water control， and the sample pretreatment process often has long experimental time and cumbersome steps. In the experiment， the pretreatment process was optimized， the drying method was changed， and the purification steps were added， which significantly improved the above problems， solved the previous technical problems， improved the work efficiency for the determination of inositol， and provided a reference for inspection institutions， food production and inspection.

Keywords： infant formula; inositol; detection method; food safety

婴幼儿食品中肌醇含量检测的标准方法为

GB 5009.270—2016第二法气相色谱法[1]，气相色谱法灵敏度高，但衍生过程较为烦琐，在测定婴幼儿乳粉、奶制品、功能饮料等样品时费时不易操作[2]，特别是在干燥这个步骤中，往往1批30个的样品需要花费24 h进行干燥处理，步骤也很烦琐，需要分几步转移样品[3]。另外由于婴幼儿奶粉的基质复杂，往往在衍生后的提取中会出现严重乳化现象，难以得到澄清的提取层，进样液也常发现有溶剂浑浊的现象，色谱图可见明显的基质干扰[3]。为了解决以上问题，本实验对前处理过程进行了方法优化，改变了干燥方法，增加了净化步骤，使上述问题得到了显著改善，解决了以往的技术难题，为本实验提高了工作效率。

1 材料与方法

1.1 实验原理

本实验将试样中的肌醇用水和乙醇提取后，分取提取液进行氮吹干燥，加入硅烷化试剂衍生，正己烷提取后经水洗净化，经气相色谱分离，外标法定量。

1.2 材料与试剂

材料：婴幼儿乳粉（市售）；肌醇标准物质（99.9%，德国，Dr Ehrenstorfer公司）；质控样品为婴幼儿/成人营养食品（National Institute of Standards and Technology，NIST），SRM/RM编号：1849a，Order编号：1905870。

试剂：无水乙醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（99.9%，上海，安谱公司）；三甲基氯硅烷/TMCS（≥99%，REGIS）；六甲基二硅氮烷（≥98%，美国，阿法埃莎（Alfa Aesar）；正己烷（色谱纯，美国Fisher Chemical公司）；无水硫酸钠（色谱纯，德国Sigma公司）；硅烷化试剂：三甲基氯硅烷和六甲基二硅氮烷和N，N-二甲基甲酰胺按体积比1∶2∶8混合超声后无白色浑浊，现配现用。

1.3 仪器与设备

8890气相色谱仪：配氢火焰离子化检测器（美国Agilent公司）；MS204TS/02 万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超纯水机（美国Milipore公司）；MS 3digital 涡旋混合器（德国IKA公司）；2600TH型数控超声波清洁器（上海安谱公司）；2-16KL 型高速离心机（德国Sigma公司）；N-EVAPTM112 氮吹仪（美国Organomation公司）；SW22振荡水浴锅（德国Julabo公司）；色谱柱：HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm，美国Agilent公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 样品前处理

提取：称取1 g（精确到0.1 mg）样品于50 mL离心管中，加入40 ℃一级水12 mL溶解并超声提取10 min，用95%乙醇定容至50 mL，摇匀静置20 min后于6 000 r·min-1离心3 min。过滤后取上清液5 mL于25 mL衍生瓶。干燥：向衍生瓶中加入2 mL无水乙醇，在80 ℃水浴下氮吹至干后放烘箱中100 ℃烘干1 h。

衍生提取：向上述衍生瓶中加入5 mL硅烷化试剂，立马盖上盖子，超声溶解5 min后放于80 ℃水浴振荡中振摇45 min后取出冷却至室温。加入5 mL正己烷，涡旋混合30 s后于8 000 r·min-1离心3 min。

水洗净化：取上层液2 mL加入2 mL水摇匀后于8 000 r·min-1离心3 min，取上层液于预先加少许无水硫酸钠的15 mL离心管中，涡旋后过0.4 μm的滤膜，待测。

1.4.2 标准工作溶液的制备

肌醇标准溶液（0.100 mg·mL-1）：称取50 mg（精确到0.1 mg）的肌醇标准物质，用25 mL水溶解并用95%乙醇定容至50 mL，摇匀。取1 mL此溶液，用70%乙醇稀释至10 mL。分别吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL肌醇标准溶液于衍生瓶中，按上述1.4.1步骤进行“衍生提取”操作。

1.4.3 仪器条件

进样口温度：280 ℃；分流比10∶1；柱温：起始温度60 ℃，以20 ℃·min-1升到240 ℃，保持1 min；然后以20 ℃·min-1升到260 ℃，后运行300 ℃，保持3 min。恒定流量：1.8 mL·min-1；进样量：1 μL；检测器（FID）温度：300 ℃。

1.4.4 计算公式

样品中肌醇的含量X按以下公式计算：

X=（C×f）/m×100             （1）

式中：X为样品中肌醇含量，mg/100 g；C为从标准曲线中获得试样测定液肌醇的含量，μg；f为试样测定液所含肌醇换算成试样中所含肌醇的系数为10；m为试样的质量，g；100为换算系数。

2 结果与分析

2.1 两种方法对比

2.1.1 干燥时间对比

两种干燥方法处理时间对比见表1。前处理干燥的步骤改用氮吹代替旋蒸，既节省了溶剂使用量也大大缩短了实验时间，平均每个样品可缩短12.5 min的干燥时间，有效提高实验效率。本方法前处理简单，需要很少的有机溶剂，对操作者和环境的危害小。

2.1.2 水洗净化前后样液对比

上机样品对比见图1。由图1可知，增加的水洗步骤能使样品得到进一步净化，消除正己烷提取后的乳化现象。

2.1.3 色谱图上的背景干扰对比

色谱图上的背景干扰对比见图2和图3。由图2和图3可知增加的水洗步骤能使样品得到进一步净化，减少由于杂质给仪器带来的污染及有效减少色谱图上的背景干扰，有效提高定性和定量的准确性。

2.2 方法验证

（1）通过采用质控样品分别按照方法优化前与方法优化后进行试验，得到样品结果与证书值（405.2±7.6）mg·kg-1做比较，每方法各平行6个样品。

优化前方法回收率在103.1%～114.7%，重复性条件下平行6样结果的变异系数为3.70%，标准曲线在10～200 μg时，校正方程的相关系数均为0.993。优化后方法回收率在98.7%～101.7%，符合GB/T 27404—2008附录F中回收率95%～105%（含量＞100 mg·kg-1时）的要求。重复性条件下平行6样结果的变异系数为1.14%，符合GB/T 27404—2008附录F中变异系数的要求；标准曲线在10～200 μg时，校正方程的相关系数均为0.998，线性范围满足标准的要求。可见，优化后方法具更高的准确度和精密度，见表2。

（2）选择质控样品通过人员比对实验对方法进行确认。人员独立测定结果的回收率分别为99.8%和100.1%，准确度和精密度均符合标准要求；标准曲线在10～200 μg时，校正方程的相关系数均为0.999，线性范围满足标准的要求。不同人员独立测定结果的相对偏差为0.30%，人员比对结果符合不同人员独立测定结果相对偏差不大于10%的验证方案要求。见表3。

经验证，新建立的方法有效解决了肌醇检测技术中的难点，优化后方法的各项技术指标均达到标准要求，表明该检测方法是有效的，满足项目开展的要求，符合预期用途。

3 结果与讨论

在肌醇检验检测的前处理过程中，涉及衍生化的操作，目前主要是分为完全衍生化和非完全衍生化，其各自的产物不同，完全衍生化生成的是一个硅氧环己烷，不完全衍生化生成的是两种产物[4]。而其衍生化程度与反应过程的温度有关，当水浴温度在70 ℃以下，待测物肌醇不能与硅烷化试剂结合生成结构稳定的六（三甲硅氧基）环己烷，而是生成结构不稳定的β-四联树胶醛醣和五（三甲硅氧基）肌醇[5]；当水浴温度分别为80 ℃、90 ℃时，硅烷化反应完全，反应产物是单一的、结构稳定的六（三甲硅氧基）环己烷；如果水浴达到90 ℃或以上时，生成的产物由于水浴温度太高而易挥发，导致其测定值的浓度降低，影响检验结果的准确性。

总结以上实验方法，除反应对温度敏感，还涉及人员在以下方面的实验操作注意事项：①对于N，N-二甲基甲酰胺、三甲基氯硅烷和六甲基二硅烷胺烷，必须保证当三者混合后无白色浑浊现象时方可使用；②硅烷化试剂放干燥柜中保存，避免吸水；③衍生实验过程应严格避免有水。

参考文献

[1]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中肌醇的测定：GB 5009.270—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[2]房子舒，黄传峰.食品中肌醇的检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2019，10（1）：14-18.

[3]廖燕芝，黄辉，梁锋.气相色谱法测定婴幼儿配方食品中肌醇的衍生方法的比较[J].食品安全质量检测学报，2018，9（17）：4639-4644.

[4]周玮婧，何平，王澍，等.婴幼儿配方奶粉中肌醇的测定及稳定性研究[J].中国乳品工业，2018，46（1）：48-51.

[5]黄伟雄，梁富荣.肌醇硅烷化反应的质谱研究[J].华南预防医学，2002，28（6）：52-53.

作者简介：陈羽中（1988—），男，广东广州人，本科，助理工程师。研究方向：食品质量与安全、实验室信息化管理系统。

通信作者：谭锦萍（1985—），女，广东阳江人，硕士，工程师。研究方向：食品质量与安全。E-mail：306218758@qq.com。