一株椰毒假单胞菌酵米面亚种在培养基中的生长规律和产毒研究

摘 要：目的：研究椰毒假单胞菌酵米面亚种在培养基中的生长规律和产毒情况，为椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌株特性研究提供参考。方法：接种不同初始菌液的马铃薯葡萄糖水（PD水），静置培养72 h，测定不同培养温度下的菌株和米酵菌酸浓度；接种同一浓度菌液的PD水，测定其不同培养方式下的米酵菌酸浓度。结果：静置培养后，低、中、高浓度菌液在4 ℃条件下72 h内未出现明显繁殖，但在26 ℃、36 ℃条件下培养出现明显繁殖，达到108 CFU·mL-1数量级后趋于平稳；4 ℃条件下的低、中、高浓度菌液和26 ℃的低、中浓度菌液培养物中均未检出米酵菌酸，26 ℃培养条件下的高浓度菌液培养物中检出的米酵菌酸浓度较低，为5.48～6.72 μg·kg-1。而36 ℃条件下的3个浓度菌液培养物中的米酵菌酸持续升高，但都低于400 μg·kg-1。接种了108 CFU·mL-1菌液的PD水采用静置、振荡培养后，米酵菌酸浓度振荡培养＞静置培养。结论：椰毒假单胞菌酵米面亚种在PD水中培养，其菌液浓度和米酵菌酸的产量与培养温度呈正相关，36 ℃和振荡方式培养有利于米酵菌酸的产生。

关键词：椰毒假单胞菌酵米面亚种；米酵菌酸；生长规律；产毒情况；培养方式

Analysis of Growth Rules and Toxic Production of Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans in

Culture Medium

YAN Qiongying， LI Leshi， SUN Yuhan， LIN Zeyu， LUO Erlun， CHEN Jing*

（Shenzhen Academy of Metrology & Quality Inspection， Shenzhen 518131， China）

Abstract： Objective： To provide a reference for the study of the strain characteristics of Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans， the growth rules and toxin production of Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans in the culture medium were analyzed. Method： The potato glucose water （PD water） was inoculated with different initial bacterial fluids， resting incubated for 72 h to determine the concentration of bacterial strain and bongkrekic acid at different culture temperatures. The PD water was inoculated with the same concentration of bacteria fluids， and determined concentration of bongkrekic acid under different culture modes. Result： After static culture， the low， medium and high concentrations of bacterial solution did not reproduce significantly within 72 hours at 4 ℃， but did reproduce significantly at 26 ℃ and 36 ℃， reaching 108 CFU·mL-1; No bongkrekic acid was detected in the low， medium and high concentrations of bacterial fluid at 4 ℃ and the low and medium concentrations of bacterial fluid culture at 26 ℃. The concentration of bongkrekic acid detected in the high concentrations of bacterial

fluid culture at 26 ℃ was low， 5.48～6.72 μg·kg-1. At 36 ℃， the rice yeast acid in the three concentrations of bacterial

liquid culture continued to increase， but all were lower than 400 μg·kg-1. After the PD water inoculated with

108 CFU·mL-1 bacterial solution was incubated by standing and shaking， the concentration of rice yeast acid in shaking culture was higher than that in standing culture. Conclusion： Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans was cultured in PD water， and its bacterial fluid concentration and the bongkrekic acid was positively correlated with the culture temperatures， and the culture at 36 ℃ and shaking mode was conducive to the production of bongkrekic acid.

Keywords： Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans; bongkrekic acid; growth rules; toxicity; culture method

椰毒假单胞菌酵米面亚种（Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans）是1977年中国学者在东北酵米面中毒事件中发现的食物中毒菌[1]，可产生毒黄素（Toxoflavin，TF）和米酵菌酸（Bongkrekic Acid，BA），能引起高致死性的食物中毒。据文献[2]报道，发病率可高达96%，病死率高，是迄今为止我国发现的发病率和死亡率极高的食源性致病菌。该菌具有与其他细菌不同的产毒特点，可产生外毒素米酵菌酸，在相同条件下，米酵菌酸产量比毒黄素大，毒性比毒黄素强[3]。

研究发现米酵菌酸是一种具有较强生物活性的毒素，随污染的食物进入人体后可引起恶心、呕吐、腹胀、腹痛等，严重者出现黄疸、腹水、皮下出血、惊厥、血尿、血便等肝脑肾实质性器官损害症状[4-6]。近几年，我国发生过多起食用含有米酵菌酸的食品导致中毒死亡的事件。例如，2012年山东省临沂市，2014年云南省文山州，2018年广东省东莞市，2020年黑龙江省均发生过食用被米酵菌酸污染的食品导致的中毒死亡事件[7-9]。

椰毒假单胞菌酵米面亚种适宜生长温度为26～37 ℃[10]，且该菌代谢多样性丰富，对碳源要求不高，在有任一可利用的有机化合物存在下即可生长繁殖，在适宜的温度和湿度条件下，短时间内可产生大量毒素[11]。孟昭赫等[12]采用正交设计法研究了实验条件下影响椰毒假单胞菌酵米面亚种的产毒能力情况，发现对产毒能力的影响程度大小依次为菌株、培养基、温度、pH值、培养时间，且最适产毒温度为26～28 ℃。黄伟峰等[13]研究椰毒假单胞菌酵米面亚种的选择性培养基时涂布接种血琼脂平板作为对照培养基进行生长率试验。汪廷彩等[14]文献报告该菌在生长过程可形成生物膜，定植于基质表面。此特性可能是GB 4789.29—2020中采用PDA半固体表面接种培养法获得菌株的代谢产物米酵菌酸的原因之一。国标中的产毒培养需要至少6 d，且培养物需冰冻过夜和过滤才得到毒素粗提液，操作复杂，耗时长。

目前针对椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株在培养基中的生长规律和产毒情况研究较少，项目组将实验室分离到的椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株接种到PD水培养基中，通过考察不同初始染菌量、不同温度（4 ℃、26 ℃、36 ℃）培养下的测定菌液浓度和米酵菌酸浓度，以及考察静置和振荡不同培养方式下测定培养物中米酵菌酸浓度的方法，研究椰毒假单胞菌酵米面亚种的生长规律与产毒情况。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株

椰毒假单胞菌酵米面亚种（本实验室编号为83756），为实验室按GB 4789.29—2020方法分离，VITEK 2 Compact全自动生化鉴定系统生化鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌，经GB 4789.29—2020方法产毒培养后采用《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》（GB 5009.189—2016）方法检出米酵菌酸。

1.1.2 主要试剂

血琼脂平板（郑州安图生物工程有限公司）；马铃薯葡萄糖水（PD水）（青岛海博）；米酵菌酸标准品（纯度96.9%，浓度1 mg·mL-1，安谱）；甲醇和乙腈（HPLC 级，德国Merck 公司）；甲酸（HPLC 级，德国CNW 公司）；氨水（分析纯，广州化学试剂厂）；色谱柱（Agilent TC C18 250 mm×4.6 mm，Agilent 公司）；超纯水（18.2 MΩ·cm，实验室Milli-Q 自制）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Ultimate 3000型，德国赛默飞世尔）；生化培养箱（SHP-250型，上海精宏）；冷藏箱（HYC-390型，海尔）；电热恒温培养箱（INE600型，德国 Memmert）；比浊仪（Densimat型，法国生物梅里埃）；恒温培养振荡器（HZP-250，上海精宏）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验用菌株培养物制备

将椰毒假单胞菌酵米面亚种83756株接种于血平板37 ℃ 培养24 h。

1.3.2 PD水静置培养菌株生长规律和产毒变化实验

挑取1.1.2血平板培养物制备0.5麦氏浊度的菌悬液，经10倍系列稀释获得102、104、106 CFU·mL-1数量级菌液作为初始污染菌液量，并将10-5和10-6稀释度菌液涂布血琼脂平板进行计数，确定接种量，以下用低、中、高浓度菌液分别代表3个数量级的菌液。同时各取1 mL菌液接种于100 mL PD水中，分为3组，分别放置于不同温度（4 ℃、26 ℃、36 ℃）下静置培养。

每12 h （培养12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）取出不同培养温度的3组培养物，取1 mL加入9 mL生理盐水稀释液中进行10倍系列稀释，选合适的2个连续梯度取0.1 mL涂布血琼脂平板，36 ℃培养48 h并计数，同时取10 g培养物按GB 5009.189—2016进行BA浓度检测。

1.3.3 PD水静置、振荡培养产毒变化实验

将约108 CFU·mL-1浓度菌液作为初始污染菌液量分别取1 mL加到PD水中，分两组，一组放置于36 ℃静置培养，另一组放置于36 ℃摇床150 r·min-1振荡培养，于24 h、48 h、72 h 3个时间点取出，取10 g培养物按GB 5009.189—2016测定其米酵菌酸浓度。

2 结果与分析