基于高通量测序技术的云南小曲清香型白酒水封发酵下的产酸特性研究

云南小曲清香型白酒凭借其别具一格的风味深受大众喜爱，在白酒的酿制流程中，发酵阶段占据着关键地位，微生物群落的改变直接左右着酸的生成及最终成品的质量。本研究借助高通量测序技术，全面剖析了水封发酵状况下云南小曲白酒里微生物群落的动态转变，以及其对酸产特性产生的作用。研究结果显示，发酵进程中乳酸菌的大量繁殖极大地增强了酸度，构建了繁杂的微生物生态体系。此项研究不仅为增进白酒的风味和品质提供了科学支撑，也为精确调控酿造进程提供了理论基石。

1.引言

在白酒的酿制过程里，发酵阶段对最终产品的风味、香气和品质发挥着举足轻重的作用。近年来，高通量测序技术的迅猛进步，给微生物群落的分析带来了全新的视角。本研究意在探究在水封发酵的状况下，云南小曲白酒中微生物群落的变动及其对酸产特性造成的影响。

2.高通量测序技术概述

2.1 高通量测序的原理与方法

高通量测序（HTS）作为一项具有开创性的技术，能够在较短时间内产出海量的DNA序列数据，并在基因组学、转录组学及微生物生态学等范畴得到了广泛运用，其根本原理涵盖了样本筹备、测序反应以及数据分析等环节。起初DNA 片段借助限制性酶切或者随机剪切等手段予以切割，以此保障片段的大小具有一致性或者呈现出多样性；紧接着展开末端修复工作，使DNA片段的末端变得平滑，为后续的连接操作创造条件；而后把特定的测序接头衔接至DNA片段的两端，这些接头促使DNA能够稳固在测序平台之上；最终凭借聚合酶链式反应（PCR）针对连接了接头的DNA片段予以扩增，从而获取充足的模板用于测序。

2.2 高通量测序在微生物研究中的应用

高通量测序在微生物研究中的应用极为普遍，特别是在转录组学和微生物群落分析领域取得了显著成效。以往的研究大多依赖培养技术，但高通量测序的诞生使在无培养条件下开展微生物多样性分析成为现实。例如，Yoder-Himes等在针对 Burkholderia cenocepacia 展开研究时借助Illumina测序察觉到了多种未曾知晓的非编码RNA，阐明了其基因组相似度和致病潜力之间的关联。Nadja Larsen 等在探究糖尿病与肠道微生物的关系时，运用454高通量测序技术对患者的肠道菌群进行剖析，发现特定微生物的分布和糖尿病发生紧密相连。

3.云南小曲清香型白酒的发酵过程

3.1 小曲白酒的生产工艺

云南小曲清香型白酒的生产工艺凭借其独有的地域特色与传统技法声名远扬，过程涵盖了原料挑选、糖化、发酵及蒸馏等步骤。在原料挑选方面，产自云南高海拔区域的红高粱乃是主要的酿酒用料，因其饱含淀粉与单宁，有力保障了酒体的丰腴和醇厚。云南当地的气候与土壤状况促使这种高粱颗粒大且坚实，所酿之酒香气馥郁口感别具一格。在糖化进程中将传统工艺和现代技术相融合，将选好的高粱予以蒸煮，促使淀粉转变为能发酵的糖分。复配的多种酒曲进行发酵，此环节极为关键，决定了酒体的香气层级和风味特点。云南的小曲白酒大多运用多曲共酿之法，借由五种酒曲的复合搭配使酒体更为醇厚、口感越发丰富。

3.2 水封发酵的特点与作用

水封发酵是在云南传统小曲酿造工艺的基础上又一创新之举，其效用在于凭借独特的物理与化学特质提升酒的品质。水封发酵选取陶缸当作发酵容器，具备出色的隔绝性能，能够切实阻拦外部细菌及有害微生物的侵入，规避杂味的出现，由此提升了酒的纯净度。

陶缸的透气性能和微氧环境能够助推酒体的氧化反应，有益于酒的陈化与风味的优化。相较于传统的密闭发酵模式，水封发酵能够有效排出在发酵进程中生成的有害气体，防止酵母带来的干扰，确保酒体的顺滑及香气的纯粹。就像菜根潭酒厂在这一技术运用方面取得成功，使其产品于市场里获得良好的口碑，消费者大都反馈其酒体更为柔和余味干净清爽。另外，水封发酵能够构建一个相对封闭的发酵空间，保障酒醅的水分均匀且稳定，进而守护酒的质量。陶缸内部的釉质涂层不单能提升发酵的卫生程度，还能使酒体在发酵过程中吸附有益成分，进一步强化了酒的层次感和复杂程度。

3.3 发酵过程中酸的产生机制

在小曲白酒的发酵过程中，酸的形成是左右酒体风味的关键要素。在发酵期间，酵母在把糖分转变为酒精时也会产出一定数量的有机酸，如乳酸、醋酸等。这些酸不仅能够对酒的酸度予以调节，使酒体更为均衡，而且还能增进酒的香气，令其在口感方面越发丰富多样。酸的生成机制主要受到发酵条件的左右，涵盖了温度、pH值以及酵母的种类等。处于适宜的温度区间内，酵母的活性能够得到充分激发，糖的发酵效率也会随之提升，进而促使酸的生成增多。举例来讲，有研究显示当发酵温度把控在25℃-30℃时，有机酸的生成显著增加，在这种温度状况下，酵母的代谢活动颇为活跃，能够有效转化糖分并产出大量的乳酸。

4.实验材料与方法

4.1 研究样本的选择

在此次研究里针对云南小曲清香型白酒样本的选取，遵循了一系列严苛的标准，以此保障样本具备代表性与可靠性。其一，我们保证样本出自拥有正规资质的生产厂家，以此确保其生产工艺的规范性与稳定性，如从知名的白酒生产企业中挑拣样本，囊括了各异的品牌与系列。其二，我们着重选择运用水封发酵工艺的白酒样本，用以强化研究对象的针对性。样本的酒精度范畴包含高度酒（40%vol-69%vol）及低度酒（25%vol-39%vol），这有益于全方位知晓不同酒精度之下的产酸特性差别。

4.2 发酵过程的监测与采样

在云南小曲清香型白酒的水封发酵流程里，借由测定发酵进程中的温度变动来知晓发酵情况。我们运用高精准度的温度计，定时测量发酵容器内多个位置的温度，然后将所得数值取均值，并将其作为发酵温度的监测数据。在发酵的初始阶段，微生物的活动慢慢变得活跃，温度也会随之逐步上升。如果温度过高或过低，都有可能对发酵的正常开展及酸的生成造成影响。

酸碱度的改变同样属于关键的监测指标之一，我们通过pH计定时测定发酵液的pH值，伴随发酵的推进，乳酸菌等微生物在代谢时产生的有机酸持续积聚，致使发酵液的pH值逐步降低。在发酵刚开始时发酵液的pH值或许在6.0上下，随着发酵的持续，pH值能够下降到4.0甚至更低。与此同时，我们对酒精含量的变动进行监测，采用酒精计或者气相色谱之类的办法，测量发酵液中的酒精含量。监测酒精含量变动，能够更有效地理解发酵过程中酸的产生原理。

4.3 高通量测序的实施步骤

就液态发酵样本而言，借助离心之类的手段来除去杂质，进而获取微生物细胞或者核酸物质；对于固态发酵样本，则需要采取研磨、破碎等举措使其达到均匀的状态。在提取核酸的过程中，要严格把控操作环境的无菌状况，运用高品质的核酸提取试剂盒，以此保障提取得到的核酸具备高纯度与完整性。完成提取之后，通过微量核酸定量仪、分光光度计等相关设备来检测核酸的浓度、纯度及完整性，从而确保符合质量标准的核酸样本能够用于后续的分析。

文库构建属于高通量测序的关键步骤，起初对提取的核酸进行片段化处置，保证片段大小契合后续操作；紧接着展开末端修复以及连接测序接头的工作，利于核酸片段和测序平台相结合；最终借助PCR扩增，大量增加核酸，得到充足的模板以供测序运用。在进行高通量测序时，需要依照样本的特点设定恰当的参数。比如，按照样本的繁杂性及微生物群落的多元性，挑拣适宜的测序深度和读长，从而获取高品质的数据。与此同时，在测序进程中，维持环境的干净和稳定，定时对测序仪进行维护与校准，以确保其性能处于最优状态。

4.4 数据分析方法

借助质量控制类工具（例如FastQC）对测序数据的质量进行查验，辨识低质量的读取内容并予以过滤。随后运用工具（诸如Trimmomatic）除掉测序接头序列，以保障数据的精准性与纯净度。按需实施低复杂度序列的过滤操作，用以降低分析过程中的噪声增进分析的准确性。

在比对环节中，选取工具（如Bowtie、BWA）将经过预先处理的测序数据和参考基因组或者转录组进行比对，从而明确每个测序读取在参考基因组上所处的位置。针对未能与参考基因组比对成功的样本，则运用组装软件（如SOAPdenovo、Velvet）实施组装获取连续片段（Contigs）。完成组装后，通过物种鉴定软件（如QIIME、Mothur）进行微生物物种的判定，依照序列的相似性，把读取分配至不同的分类单元。就多样性分析来说，核算微生物群落的多样性指数（如Shannon指数、Simpson指数），评定其丰富程度和均匀程度。另外，通过主坐标分析（PCoA）等方式，将微生物群落的结构差异予以可视化呈现。最后进行差异表达分析，用以辨别在不同发酵条件下出现显著变化的微生物和基因，从而为后续的研究提供线索。

5.结果与讨论

5.1 水封发酵下微生物群落的变化

经由高通量测序技术的解析，我们可以发现云南小曲清香型白酒水封发酵进程里的微生物群落历经了显著的变动。在发酵初始阶段，厚壁菌门与变形菌门属于主要的细菌优势菌门，前者的乳酸菌逐步于后期处于主导地位。乳酸菌的代谢行为造就了大量乳酸，由此显著提升了发酵体系的酸度，进而对风味物质的形成造成影响。举例来讲，在发酵起始的前两天，乳杆菌属的相对丰度较为平稳，不过在发酵第三天往后迅猛增长，一直到第五天抵达峰值，这显示出乳杆菌在该过程里发挥了关键作用。确切来说，立克次体菌属在发酵初期所占的比例较高，然而，伴随发酵的推进，其相对丰度持续降低，这表明其在低氧、高酸及高酒精的环境中生存的能力存在局限，与之相反的是，乳酸菌类的增多使其变成发酵体系里的优势群体。

5.2 酸产量的定量分析

对酸产量的定量测定表明，云南小曲清香型白酒于发酵进程中的酸产量呈现出显著的阶段性变动。在发酵起始阶段酸的产出量较少，关键在于微生物群落尚未充分构建产酸微生物的数量及代谢活性处于低位。伴随发酵的深入，酸的产量逐步增加，进入相对平稳的时期，这和乳酸菌的繁衍及其代谢活动的强化紧密相连。

在发酵的末期，酸的产量或许会产生起伏，这和众多因素有关。其一，随着酒精浓度的提高，部分产酸微生物的活性或许会遭受抑制；其二，其他微生物的代谢活动也可能对酸的生成造成影响。其三，温度与配糟比例的改变对酸的产量作用明显。研究指出，最优的发酵温度处于20℃-30℃范围内，此时酸的生成较为稳固。处于高温或者低温的环境时，酵母的活性与代谢效率会大幅降低，致使酸的产量降低。优化发酵温度和周期，能够切实提升酸的产量，为白酒的质量把控提供强劲的支撑。

5.3 不同发酵条件对酸产特性的影响

不同的发酵条件对酸的产量具有显著影响，温度和配糟比例属于其中的关键要素。研究显示，一旦发酵温度超出38℃，酒曲微生物的生长会受到抑制，甚至可能导致酸的产量下降。举例来讲，如果发酵初期温度上升至41℃，或许会造成酵母菌提前衰亡，对产酸和出酒率产生影响；反之，在温度恰当的状况下，微生物的代谢活动得以增强，酸的生成量明显提高。

研究里常规的配糟质量是酸度1.10-1.18，水分67%，稻壳含量12%，淀粉含量5%-5.1%。如果配糟质量不平稳，如酸度过高或者水分含量过大，就会直接干扰发酵的正常开展，进而导致酸的生成匮乏。

5.4 结果的比较与讨论

经过对上述成果的全面剖析，我们能够确切地洞察到微生物群落变动跟酸产量的关联，还有不同发酵状况对其造成的作用。这些成果显示微生物群落的动态改变，不仅左右着发酵进程中酸的生成，也对最终的风味特质产生了影响。特别是在发酵期间乳酸菌的快速增多，以及相对丰度的改变，直接与酸的产量起伏相对应。与此同时，发酵条件的改进为增进云南小曲清香型白酒的质量提供了科学根据。温度的恰当把控及配糟的合理运用，不仅能够推动微生物的繁衍，还能最大限度地增加酸的产量，进而完善酿造流程，最终增强产品的口感和风味。

作者简介

赵刚（1985.09-），男，汉族，云南楚雄人，大专，国家一级品酒师，酿酒师；研究方向：云南小曲清香型白酒微生物发酵、生产技术，酒体设计等。

庞春雄（1988.11-），男，汉族，云南昆明人，大专；研究方向：白酒生产酿造。

庞浩（1984.09-），男，汉族，云南昆明人，高中；研究方向：白酒生产酿造。

付树良（1982.03-），男，汉族，云南昌宁人，大专；轻纺工程、酿酒工程工程师；研究方向：发酵工程。