猕猴桃新烟碱类农药样品前处理提取工艺的优化

猕猴桃也称奇异果，属猕猴桃科猕猴桃属，是一种落叶藤本果树，是20世纪野生果树人工驯化栽培最有成就的果树之一，在我国栽培范围较广。猕猴桃富含维生素C，被称为水果之王，果实中含有丰富的矿物质元素、维生素、多酚等成分，风味独特、营养价值高，具有广泛的观赏、食用和药用价值，研究开发潜力巨大。据统计，全世界猕猴桃属植物共有54个种、21个变种，约75个分类单元，在我国分布的约为52个种，其中44个为中国特有。六盘水红心猕猴桃较之其他品种质量更优，目前已获得国家地理标志产品的称号。新烟碱类农药是一类高效广谱的杀虫剂，这类农药在农业害虫防治中发挥着重要作用，具有高效、广谱、低毒、低残留等特点。自1991年开发出来后，就迅速成为有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等剧毒类杀虫剂的替代品，是继拟除虫菊酯类杀虫剂之后的第四代杀虫剂。截至2021年9月，在我国登记的新烟碱类农药有12种，分别为哌虫啶、吡虫啉、噻虫嗪、噻虫啉、氯噻啉、呋虫胺、啶虫眯、噻虫胺、环氧虫啶、烯啶虫胺、氟啶虫胺腈和氟吡呋喃酮喃。根据对六盘水当地往年猕猴桃农药残留监测情况来看，噻虫嗪、吡虫啉和啶虫脒是当地较为常用的新烟碱类农药，这些农药会通过饮食、呼吸、接触的方式进入人体，并对人体造成神经毒性、肝毒性、生殖毒性等危害，目前世界上多个国家及组织已开始对其限制使用。为了更好地保护当地猕猴桃产业，合理有效地监测当地猕猴桃健康态势，本文优化了新烟碱类农药样品前处理的提取工艺，并对其进行了验证。

1.材料与方法

1.1 试验材料与试剂

微孔过滤膜（尼龙）：13 mmX0.2 um；Sep-Pak Vac1氨基固相萃取柱：1g，6mL；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、丙酮（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、甲苯（优级纯）、无水硫酸钠（分析纯）、氯化钠（优级纯）、娃哈哈纯净水，噻虫嗪、吡虫啉和啶虫脒标准品。

1.2 仪器设备

HZQ-Q恒温振荡器，ME104E/02电子天平，N-1300旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），AXTG20G离心机（盐城市安信实验仪器有限公司），LCMS-8040液相色谱-串联三重四极杆质谱仪（日本岛津公司）：配有电喷雾离子源，高速均质机。

1.3 样品前处理

提取：准确称取20g猕猴桃试样置于100mL的离心管中，加入一定量的乙腈。之后用高速均质机在一定转速下，匀浆提取一定时间。然后再加入5g氯化钠盐析，提取1min，在4000r/min离心5min。最后在一定温度下，水浴中旋转浓缩至约lmL，待净化。

净化：在Sep-Pak Vac柱中加入脱水剂，并放入下接鸡心瓶的固定架上。用4mL（乙腈：甲苯/4：1）预洗柱后加入上述浓缩液，并更换新鸡心瓶接收。再每次用2mL（乙腈：甲苯/4：1）洗涤样液瓶三次﹐并将洗涤液移入柱中。在柱上加上50mL贮液器，用25mL（乙腈：甲苯/4：1）洗脱农药及相关化学品，合并于鸡心瓶中，并在一定温度下水浴旋转浓缩至约0.5mL。将浓缩液置于氮气吹干仪上吹干并迅速加lmL的乙腈：水/3：2），混匀。经0.2μm滤膜过滤后进行液相色谱-串联质谱测定。

1.4 测试条件

色谱柱：色谱柱：Atlantis T3，（150 mmx2.1mm，3um.）；柱温：40℃；进样量：20μL。流动相的选择及梯度洗脱条件间表1。

2.结果与分析

2.1 不同条件对猕猴桃加标的回收率的影响

图1可知三种提取溶剂（丙酮、乙腈、乙酸乙酯）中，乙腈的加样回收率最高，达到了81.2%，说明乙腈的提取效果优于丙酮和乙酸乙酯。图2是不同脱水剂对加样回收率的影响，从图2可知无水硫酸钠的脱水效果最高，加样回收率达到了83.1%。为了考察净化剂对样品加样回收率的影响，本文做了C18、N-丙基乙二胺、石墨化炭黑三种净化剂对加样回收率的影响。如图3所示，在相同条件下，仅改变净化剂种类，样品加样回收率不同，图中N-丙基乙二胺的加样回收率最高为91.4%。样品的提取方式对加样回收率至关重要。图4为显示了四种不同的提取方式（振荡、高速涡旋、超声提取、高速均质）对加样回收率的影响。

2.2 正交试验分析

以料液比（Ａ）、提取时间（B）、搅拌速率（C）、旋蒸温度（D）为考察因素，以猕猴桃加标的回收率为考察指标，设计正交试验。因素水平见表2。

本实验选取的L9（33）正交表。各实验因素对加样回收率的影响如表3所示。根据正交试验理论，极差越大，该因素越占主导地位。因此，影响猕猴桃加样回收率的主次因素为：提取时间（B）＞搅拌速率（C）＞旋蒸温度（D）＞料液比（A），得到最佳试验条件为：A2B2C2D2，即料液比为1：3，提取时间为4min，搅拌速率为15000r/min，旋蒸温度为50℃。

为了考察试验的重复性，按照A2B2C2D2最佳工艺进行试验，验证3次，结果见表4。

由表4可知，在最佳实验条件下所测得的加样回收率变化幅度不大，重复性较好，平均加样回收率为84.3%，说明最佳工艺条件改性所得到的样品加样回收率最佳。

结论

本研究考察了不同条件对猕猴桃加标的回收率的影响，结果显示：在样品前处理过程中，乙腈为最优的提取溶剂，无水硫酸钠为最优的脱水剂，N-丙基乙二胺为最优的净化剂，最佳的提取方式为高速均质。此外，采用正交试验法对猕猴桃样品前处理的提取步骤进行了工艺优化，确定了最佳提取工艺为料液比为1：3，提取时间为4min，搅拌速率为15000r/min，旋蒸温度为50℃。

基金项目

六盘水市科技项目（52020-2021-0-3-13；52020-2021-0-3-14）。

*通信作者

袁瑷金（1983-），女，本科，高级农艺师；研究方向：食品检测。