高效液相色谱法测定灵芝中苯甲酸、山梨酸、糖精钠含量

建立高效液相色谱法测定灵芝中苯甲酸、山梨酸、糖精钠含量的测定方法。采用高效液相色谱法，色谱柱为C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流速为1.0mL/min，波长为230nm，流动相为0.02moL/L乙酸铵：甲醇（95：5），样品经粉碎后，沉淀蛋白质，加水超声并提取，离心后经滤膜过滤注入液相色谱仪。结果表明，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的分离度较大，加标回收率范围在92.4%-101.2%之间;相关系数（r）大于0.9999，具有良好的线性关系;检出限是0.168mg/kg-0.555mg/kg，定量限是0.560mg/kg-1.850mg/kg。由此可以得出结论，该方法处理快速，分离效果好，适用于真菌类食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检测。

灵芝是多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang 的干燥子实体。灵芝的化学成分丰富，主要包括多糖成分，核苷酸，生物碱类、三萜类、甾醇类、甾体、多肽化合物，脂肪酸、氨基酸、微量元素等。灵芝作为传统食用菌，具有较多药理作用，近代临床应用普遍，可以保护肝脏、抗氧化及提高免疫力、抗癌症、改善机体代谢。野生灵芝对生长环境的要求较高，造成产量较低，无法满足市场对灵芝的需求。这就需要人工栽培来增加灵芝的产量。但在人工栽培过程中，由于栽培方式及气候环境不同，会引起灵芝的质量参差不齐，这就需要使用添加剂来改善产品质量。现在，在国家食品安全标准已经批准使用的食品添加剂中，防腐剂有苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸等，甜味剂有安赛蜜、糖精钠等。苯甲酸是以石油甲苯为原料，经催化氧化、精制提纯得到的;山梨酸是用丁烯醛、乙酸反应制得的;糖精钠是以苯二甲酸酐为原料化学合成的。苯甲酸、山梨酸是防腐剂，能够抑制微生物生长，可用来杀菌保鲜，延长保存时间;糖精钠是甜味剂，甜度是蔗糖的300-500倍，可用来改善口感。苯甲酸、山梨酸、糖精钠是食品生产中常用的防腐剂和甜味剂。但是过量使用会产生毒副作用，引发癌症，对人体造成危害，影响食品安全。灵芝是对人体有益的真菌，既可以用于临床治疗，也可用于预防疾病，检测灵芝中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量具有重要意义。

目前，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的主要检测方法有离子色谱法、液相色谱法、气相色谱法和超高效液相色谱-串联质谱法。液相色谱法是利用流动相与固定相对待测组分亲和力的差异，分离出待测组分，以保留时间定性，实现对待测成分的分析。具有适用范围广、操作简单、灵敏度高、结果准确的特点。本研究参考GB 5009.28-2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》，采用高效液相色谱法对灵芝中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠进行含量测定，蛋白质沉淀剂亚铁氰化钾、乙酸锌快速沉淀蛋白质，优化了样品前处理方法及色谱条件，为真菌类食品灵芝的防腐剂、甜味剂检测提供依据。

1. 实验材料与方法

1.1 仪器设备

UItimate3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）;C18色谱柱（Thermo Fisher Scientific，Hypersil GOLD AQ）;SB-1500DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;XSE104型电子分析天平（梅特勒-托利多国际贸易（中国）有限公司）;TGL-16M高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）;EUG60-DUV实验室超纯水器（山东尤根环保科技有限公司）。

1.2 标准品、试剂及材料

苯甲酸、山梨酸、糖精钠溶液标准物质（中国计量科学研究院）;乙酸锌、亚铁氰化钾、乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），甲醇（色谱纯，fisher chemical）;实验用水为一级水;微孔滤膜（0.22μm，天津市津腾实验设备有限公司）。

1.3 样品

市售灵芝。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液的制备

精密量取苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准溶液适量，用水制成含有苯甲酸、山梨酸、糖精钠浓度为0、1、5、10、20、50μg/mL的不同浓度水平的混合标准溶液。

1.4.2 样品的制备

取样品适量，粉碎，精密称定2g，加入2mL亚铁氰化钾溶液及2mL乙酸锌溶液，加水至40mL，摇匀，超声提取20分钟。随后移入离心管中，4000r/min离心10分钟，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，作为上机液。

1.4.3 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）;流动相：95%乙酸铵溶液（0.02mol/L）-5%甲醇（0.002%甲酸）为流动相，等度洗脱;流速：1.0mL/min;检测波长：230nm;进样量：10μL。

1.4.4 样品的测定

精密量取10μL标准溶液及样品溶液，注入液相色谱仪，根据标准曲线得到样品溶液中苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）的质量浓度。

2. 结果与分析

2.1 回收率实验

在样品11中加入高、中、低3种浓度水平标准溶液，每种浓度制备3份样品溶液测定，苯甲酸、山梨酸、糖精钠回收率范围分别为92.4%-101.2%、95.7%-100.7%、94.0%-99.5%，满足实验条件。结果见表1。

2.2 精密度实验

精密吸取浓度为10μg/mL的混合标准溶液10μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积。结果显示，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的RSD均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.3 重复性实验

精密称取6份样品11，按1.4.2样品的制备项下方法处理样品，精密量取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，得到苯甲酸、山梨酸、糖精钠的RSD均不大于5%，说明重复性良好。

2.4 线性和范围

精密量取10μL不同浓度水平的混合标准溶液分别注入液相色谱仪中，得到苯甲酸、山梨酸、糖精钠相应的峰面积，以混合标准溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见表2。苯甲酸、山梨酸、糖精钠在0-50μg/mL的范围内，相关系数不低于0.9999，从结果可以看出，具有良好的线性关系。

2.5 检出限和定量限实验

方法检出限（MDL）和定量限（MQL）分别以3倍和10倍的信噪比得结果计算，苯甲酸的检出限为：0.216mg/kg，定量限为：0.719mg/kg;山梨酸的检出限为：0.168mg/kg，定量限为：0.560mg/kg;糖精钠的检出限为：0.555mg/kg，定量限为：1.850mg/kg。方法的检出限和定量限较低，表明检测灵敏度较高，可以达到分析条件。

2.6 样品分析结果

精密量取10μL平行样品溶液，注入液相色谱仪，测定待测成分的峰面积，根据标准曲线得到待测成分的浓度，计算出含量。结果见表3。

结论

根据GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，真菌类食品中不得使用。不同厂家灵芝中的苯甲酸全部检出;山梨酸有2个厂家未检出，其余厂家检出;糖精钠全部未检出。由测定结果可以看出，在灵芝中添加防腐剂苯甲酸、山梨酸是厂家较常用的工艺，有必要对真菌类食品中的苯甲酸、山梨酸的添加情况进行监管，改进生产工艺。

运用高效液相色谱法测定灵芝中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠，前处理操作简单，分离度大，精密度高，重复性好，分析时长较短，使用仪器设备易得，所需样品、试剂较少。本实验优化了液相色谱条件，在流动相中加入少量甲酸，可以更好地分离待测组分与杂质，避免了干扰峰对待测组分含量引起偏低、偏高或者假阳性结果的情况，提高了检测结果的准确度。通过对方法学的精密度实验、重复性实验、加标回收实验、线性及范围、方法检出限和定量限的验证，结果表明，高效液相色谱法测定灵芝中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠是一种较为有效的方法。本文所建立的灵芝中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定方法，可以了解真菌类食品中防腐剂、甜味剂的使用情况，为真菌类食品中防腐剂苯甲酸、山梨酸及甜味剂糖精钠的含量测定提供技术支持。

作者简介：

冯凯（1984.08-），男，汉族，山东省济宁市人，大学本科，工程师;研究方向：食品检验检测。