西瓜遗传转化体系的优化

摘 要：以8种基因型西瓜为试验材料，通过统计不同基因型材料的发芽率、不定芽诱导率，筛选出再生能力较强的基因型，并以其为材料对种子播种后培养时间、外植体造伤方式、菌液浓度、共培养时间及侵染方式等进行优化筛选，旨在建立高效的西瓜遗传转化体系。结果表明，在播种2 d时，YL、CYY298、CYY171及CYY137之间的种子发芽率差异不显著且均显著高于其他材料，但在不同浓度GA3诱导下，YL外植体的不定芽诱导率均最高；以YL材料为基础进行体系优化，发现播种2 d后的种子状态最适于侵染；刀片划伤后的外植体荧光亮度最强，荧光率最高达74.9%；菌液浓度OD600=0.8，共培养时间为3 d时，外植体分化状态最佳且荧光率最高为70.3%；真空负压方式可以显著提高侵染效率，外植体荧光率可达71.8%，愈伤组织诱导率高达60.2%；分化培养基中添加0.5 mg·L-1的GA3后不定芽的诱导率最高为74%；生根培养基中添加0.5 mg·L-1的IBA时生根率最高，平均生根数最多。

关键词：西瓜；遗传转化；转化效率；体系优化

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）03-09-11

Optimization of the genetic transformation system in watermelon

LI Pengfei，CHEN Zihao，ZHANG Minjuan，DOU Junling， YANG Sen， LIU Dongming， NIU Huanhuan，YANG Luming

（Horticulture College of Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046， Henan， China）

Abstract： In this study， eight watermelon genotypes were used as experimental materials， the germination rates and adventitious buds induction rates of different genotypes were counted and analyzed to screen out the optimal genotype with strong regeneration ability. The efficient watermelon genetic transformation system was optimized and screened through different sowing times， explant injury methods， bacterial liquid concentration， co-culture time， infection methods and other factors. The results showed that the seed germination rates of YL， CYY298， CYY171 and CYY137 had no difference and were significantly higher than that of other materials at 2 days of seeding， but the germination induction rate of YL was the highest at different concentrations of GA3. The system was optimized based on YL material， and it was found that the seed germination state was the best and most suitable for infection after 2 days of sowing. The fluorescence brightness of the explants after scratching the blade was the strongest， and the fluorescence rate was up to 74.9%. When the concentration of bacterial solution was OD600=0.8 and the co-culture time was 3 days， the explants were in the best differentiation state and the fluorescence rate was the highest at 70.3%. The infection efficiency can be significantly improved by negative pressure infection， and the fluorescence rate of explants can reach 71.8%， and the callus induction rate can reach 60.2%. The induction of adventitious shoots was up to 74% after the addition of 0.5 mg·L-1 GA3 to the differentiation medium.The highest rooting rate and the highest average number of roots were observed when 0.5 mg·L-1 of IBA was added to the rooting medium.

Key words： Watermelon; Genetic transformation; Transformation efficiency; System optimization

西瓜（Citrullus lanatus）是最受欢迎的园艺作物之一，因果肉多汁和口感甜美而备受消费者青睐。西瓜栽培历史悠久，地域广泛，近年来随着种植面积和产量的增加，个性化育种需求也在不断增加。高效稳定的遗传转化技术对于改良西瓜品种具有巨大潜力[1]。大量研究表明，西瓜是一种较难进行遗传转化的作物，转化效率低仍是目前阻碍西瓜转基因的主要难题[2]。传统育种方法在西瓜优良性状改良中存在育种周期长、难度大和遗传性状不稳定等问题，因此，利用转基因技术改良西瓜性状尤为重要。尽管转基因技术在许多作物上已取得突破，但在西瓜中的应用进展缓慢且大部分研究仍集中在如何提高转化效率方面。因此，通过优化影响西瓜遗传转化效率的因素，建立高效稳定的西瓜遗传转化体系对创制优良西瓜种质具有重要意义[3]。

植物遗传转化是一种通过将外源基因或DNA片段有目的地插入到受体植物基因组中，通过再生体系诱导获得新植株的技术[4-5]。目前，遗传转化主要使用基因枪法[6-7]、花粉管通道法[8]、DNA浸胚法[9-10]和农杆菌介导法[11-15]等技术手段将外源基因导入植物基因组，以农杆菌介导法最为常用，具有操作简单、转化效率高和遗传稳定性强等特点[16]。农杆菌能够将携带外源基因的Ti质粒上的一段DNA转移到植物细胞中，并整合到植物基因组中以实现表达[17-18]。通过农杆菌侵染，实现了外源基因向植物细胞的转移和整合，进一步利用植物细胞的全能性，通过细胞或组织培养，最终由一个转化细胞再生成完整的转基因植株。通过植物遗传转化技术，可以向西瓜中导入具有抗病性[19]、耐逆性[20]、提高产量和品质[21]等优良性状的外源基因，从而改良或增加西瓜的优异性状。然而，目前西瓜的遗传转化研究仍处于起步阶段，急需进一步优化。

西瓜离体再生能力和转化效率受多种因素的影响，包括种子贮存时间[22]、基因型[23]、苗龄[24]、外植体类型[25-26]和子叶部位[27]等内部因素，以及培养基中激素种类如6-卞基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和浓度[24，28]、预培养时间[28]、共培养条件[29-30]等外部因素。笔者以8个基因型西瓜为试验材料，通过统计不同基因型种子的发芽率、不定芽诱导率，最终筛选出YL为最优受体材料。以YL材料为基础，通过对培养基中激素浓度、侵染方式、外植体造伤方式、菌液浓度、共培养时间等条件进行优化，筛选出高效且稳定的西瓜遗传转化体系，以期为西瓜基因功能研究及优良种质创制提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料及地点

供试西瓜材料共8种，分别为YL、M08、CYY171、CYY298、CYY137、WT2、WT4和WT8。其中YL、M08由西北农林科技大学李征教授实验室馈赠；WT2、WT4、WT8是由河南农业大学瓜类作物基因组与分子育种实验室从商品种中经多代自交分离纯化的自交系，CYY171、CYY298、CYY137是由河南豫艺种业科技发展有限公司谭慧明老师提供的育种材料。

试验于2021年9月至2022年4月在河南农业大学园艺学院瓜类作物基因组与分子育种实验室进行。

1.2 培养基配方及方法

1.2.1    培养基配方    播种培养基：6.7 g 琼脂粉溶解于1 L超纯水。侵染液：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超纯水，加入6-BA（终质量浓度1.5 mg·L-1），调pH至5.8～6.0。共培养培养基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超纯水，加入6-BA（终质量浓度1.5 mg·L-1），调pH至5.8～6.0。分化培养基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超纯水，加入6-BA（终质量浓度1.5 mg·L-1），调pH至5.8～6.0，加入特美汀（终质量浓度200 mg·L-1）。芽伸长培养基：4.43 g MS 524，30 g蔗糖，1 g肌醇，500 μL SH有机溶剂（0.5 g烟酸、0.5 g维生素B1、0.05 g维生素B6溶解于500 mL无菌水），溶解于1 L超纯水，分别加入6-BA（终质量浓度0.1 mg·L-1）、NAA（终质量浓度0.1 mg·L-1），调pH至5.8～6.0，加入特美汀（终质量浓度200 mg·L-1）。生根培养基：4.43 g MS 519，30 g蔗糖，溶解于1 L超纯水，调pH至5.8～6.0，加入特美汀（终质量浓度200 mg·L-1）。除播种培养基及侵染液外，其余培养基均需调pH后加入7 g·L-1的琼脂粉以使培养基凝固；所有培养基均须在121 ℃下灭菌20 min。

1.2.2    种子处理及发芽率统计    挑选饱满健康的西瓜种子，用适量55 ℃的无菌水浸种30 min后剥去外种皮，置于无菌三角瓶后移至超净工作台，先用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗2～3次；再用5%次氯酸钠浸泡10 min（期间不断摇晃），无菌水清洗4～5次，置于播种培养基上，放于28 ℃恒温培养箱进行暗培养。每个西瓜材料设置3个重复，每个重复40粒种子，播种2 d后观察每个基因型材料的发芽状态，并分别统计发芽率，待种子下胚轴伸长至1～2 cm并有根毛长出时，获得外植体并进行不定芽诱导。

发芽率/%=发芽种子数/种子总数×100。 （1）

1.2.3    不定芽的诱导培养    将上述8种适于不定芽诱导的西瓜种子，用无菌刀片于超净工作台上将子叶远胚轴端，胚轴及子叶近胚轴端的部分组织切去（图1-Ⅰ），将剩余部位的上下两片子叶均匀切成12个外植体（图1-Ⅱ），将外植体接种至含有不同赤霉素（GA3）质量浓度梯度（0、0.5、1.0、1.5和2.0 mg·L-1）的分化培养基上，在正常光周期（28 ℃，光照16 h·d-1，黑暗8 h·d-1，光照度3000 lx）条件下进行不定芽的诱导。每个处理设置3个重复，每个重复接种100个外植体，每个培养皿接种10个外植体。14 d后继代一次，28 d后观察出芽情况并统计不定芽的诱导率，根据结果筛选出再生能力最佳的基因型和不定芽诱导率最高时的GA3浓度。