苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

摘    要：以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶（phytoene dehydrogenase，PDS）基因为靶标，构建其特异gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以期为建立苦瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系B07叶片cDNA为模板，同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。结果表明，McPDS基因CDS序列全长1731 bp，编码576个氨基酸，蛋白质相对分子质量为64.44 kD，理论等电点（PI）为7.09。跨膜结构分析结果表明，该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明，McPDS与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的PDS蛋白同源性较高。此外，以McPDS为靶标基因，在5’端筛选2个高特异性靶点，经设计引物，成功构建1个双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体，为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。

关键词：苦瓜；McPDS；基因克隆；载体构建；基因编辑

中图分类号：S642.5 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）03-020-08

Cloning and CRISPR/Cas9 gene editing vector construction of McPDS in bitter gourd（Momordica charantia L.）

HAN Xin1， 2， GUO Jinju1， ZHANG Huiyao1， WU Tingquan1， ZHANG Changyuan1

（1. Institute of Facility Agriculture， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， Guangdong， China; 2. College of Horticulture & Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， Hubei， China）

Abstract： A gRNA-specific CRISPR/Cas9 gene editing vector targeting phytoene dehydrogenase （PDS） gene of bitter gourd was constructed， hoping to lay a foundation for the establishment of CRISPR/Cas9 gene editing technology system of bitter gourd. In this study， the CDS region of McPDS gene was cloned from the leaf cDNA of bitter gourd inbred line B07. The results showed that the coding region length of McPDS was 1731 bp， encoded 576 amino acids，the theoretical relative molecular weight was 64.44 kD， and the theoretical isoelectric point（PI） was 7.09. The transmembrane structure analysis showed that the protein was a hydrophilic non-transmembrane protein. Phylogenetic analysis showed that McPDS had high homology with PDS proteins in cucurbit plants such as cucumber and melon. In addition， using McPDS as the target gene， two highly specific targets were screened at the 5' end， primers were designed， and a double-target CRISPR/Cas9 gene editing vector was successfully constructed， which laid a technical foundation for the establishment of bitter gourd gene editing system.

Key words： Bitter gourd；McPDS；Gene cloning；Vector construction；Gene editing

苦瓜是葫芦科（Cucurbitaceae）苦瓜属（Momordica charantia L.）一年生攀缘草本植物，广泛分布在热带、亚热带和温带地区[1-3]。苦瓜药膳兼用，富含维生素、膳食纤维、粗蛋白、氨基酸等营养物质和皂苷、酚类、类黄酮、多糖等化合物[4]，具有降糖、降脂、抗病毒、防衰老等多种药理作用[5-6]，深受广大消费者青睐，市场前景广阔。

八氢番茄红素脱氢酶（phytoene dehydrogenase，PDS）是类胡萝卜素合成途径中的关键限速酶，与ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）和类胡萝卜素异构酶（CRTISO）共同催化八氢番茄红素合成番茄红素，影响番茄红素及下游类胡萝卜素的生成[7-8]。PDS基因编码的蛋白主要位于叶绿体的类囊体膜上，对叶绿体具有光保护作用，其功能的缺失会导致叶绿素降解，造成光漂白现象[9]。由于该表型明显，易于观察，PDS基因常被用作报告基因，建立病毒诱导的基因沉默（VIGS）体系和基因编辑技术体系等，对基因功能研究和作物遗传改良具有重要意义[10]。

CRIPSR/Cas9系统是新近发展起来的一种高效、精准的基因组编辑技术，已成功应用于拟南芥、烟草和水稻等多个物种中，实现了基因定向编辑[11]。目前该技术正在被广泛应用于植物基因功能鉴定和品种改良等领域，具有广阔的应用前景。Zeng等[12]利用CRIPSR/Cas9系统对水稻的PIN5b、GS3和MYB30基因同时进行定点突变，获得的突变体分别表现出穗长增加、粒径增大和耐寒性增强等特点。Santosh等[13]利用CRISPR/Cas9方法在籼稻CV.MTU1010基因组中创建了突变等位基因DST∆184-305，该基因有助于提高籼稻品种的耐旱耐盐性和产量。在番茄中，通过CRISPR/Cas9技术敲除SP5G、SlMYB12、AGL6等基因，可使果实产量快速提升[14]、高效获得粉红果色番茄[15]和无籽果实[16]。马存发等[17]利用CRISPR/Cas9技术敲除青花菜的BoSP11基因，创制了花期自交亲和材料。

目前，利用CRIPSR/Cas9系统对苦瓜基因进行定点编辑的研究还未见报道。笔者以苦瓜自交系B07叶片为试材，采用RT-PCR技术同源克隆苦瓜McPDS基因，对其编码蛋白的理化性质、结构特征及保守结构域等进行分析，并以该基因为靶标，利用CRIPSR/Cas9系统构建双靶点基因编辑载体，以期为苦瓜基因编辑体系的建立及农艺性状的定向改良奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用植物材料B07是由广东省农业科学院设施农业研究所选育的高世代、大顶类型苦瓜自交系，于2023年3月下旬种植于广东省农业科学院白云试验基地，常规管理。于幼苗四叶一心时，取其嫩叶立即放入液氮速冻，并于-80 ℃冰箱保存备用。

植物总RNA提取试剂盒SV Total RNA Isolation System Kit（Promega，美国），反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Kit（TaKaRa，日本），DNA凝胶回收试剂盒（TIANGEN，德国），pMD-19T Vector、T4 DNA连接酶（TaKaRa，日本），限制性内切酶BsaI（NEB，美国），质粒小提中量试剂盒（TIANGEN，德国），大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 McPDS基因克隆

提取苦瓜叶片总RNA，反转录合成cDNA。利用Primer Premier 5.0设计McPDS基因序列特异性引物，引物序列如下：McPDS-F：ATGTCACTATGTGGATCTGTCTCTG；McPDS-R：TCACCGAACGCCCGCCTCAGC。PCR反应体系（20 μL）：PrimeSTAR Max Premix （2X） 10 μL，引物McPDS-F/R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，模板（cDNA）1 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸4 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶、纯化回收目的片段。

目的片段加A尾后连接至克隆载体pMD19-T。连接反应体系及条件：pMD19-T Vector 1 μL，目的片段4 μL，SolutionⅠ 5 μL，16 ℃连接30 min。采用热激法将重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含100 mg·mL-1氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养16 h，筛选到的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3 McPDS蛋白生物信息学分析

利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）在线分析McPDS蛋白的理化性质；利用ProtScale（http：//web.expasy.or g/protscale/）对McPDS蛋白进行亲水性分析；通过在线软件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析McPDS蛋白的保守结构域；利用TMHMM 2.0 Server （TMHMM 2.0 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services）分析McPDS蛋白跨膜结构；通过Signal P 4.1 Server （SignalP 4.1 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services）预测McPDS蛋白信号肽；分别利用PRABI（npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和Swiss-Model（Swissmodel.expasy.org）预测McPDS蛋白的二级和三级结构；采用ClustalW和MEGA-X软件进行氨基酸多序列比对及系统进化树构建。

1.4 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

1.4.1 gRNA靶点选择和靶标引物设计 利用在线网站CRISPOR（http：//crispor.tefor.net/）进行靶位点选择，最终筛选出2个靶位点，序列分别为：靶标1：GGAGAACAGCATCTCHAGGTTGG；靶标2：AAAGTAGTGATCGCTGGTGCAGG。根据靶点序列合成相应的靶点引物，序列如下：CrMcPDS-F：CAGTGGTCTCATGCAGGAGAACAGCATCTCGAGGT；CrMcPDS-R：CAGTGGTCTCAAAACGCACCAGCGATCACTACTTT。

1.4.2 CRISPR/Cas9表达载体构建 利用引物CrMcPDS-F/CrMcPDS-R扩增“gRNA1+骨架+tRNA+ gRNA2”序列，PCR反应体系（50 μL）：Biorun Pfu PCR Mix 25 μL，CrMcPDS-F 1 μL，CrMcPDS-R 1 μL，模板（SEQ1）1 μL，Nuclease-free Water 补足至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 54 s，循环30次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。目的片段经切胶、回收后，酶切连接至载体PHsbdcas9i，获得pHSbdcas9i-McPDS-gRNA表达载体。酶切连接体系：10×Buffer 2 μL，BsaⅠ 1 μL，T4_ligase 1 μL，PHsbdcas9i 4 μL，胶回收产物 4 μL，Nuclease-free Water 补足至20 μL。反应条件：37 ℃ 20 min；37 ℃ 10 min，20 ℃ 10 min，循环5次；37 ℃ 20 min，80 ℃ 5 min。上述使用的模板SEQ1序列为：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgca。