番茄SlMYB48基因生物信息学及表达分析

收稿日期：2023-10-10；修回日期：2023-12-20

基金项目：烟台市科技计划项目（2022XCZX091）；国家现代农业产业技术体系专项（CARS-23-G11）；重庆市巫山县科技项目（wskjdxbxm2023004）；国家自然科学基金面上项目（32372737）；西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室开放课题（SKL-KF202224）

作者简介：刘佳凤，女，在读硕士研究生，研究方向为番茄抗逆基因的验证。E-mail：19558916823@163.com

通信作者：李   涛，男，正高级农艺师，研究方向为蔬菜育种及分子生物学。E-mail：ytnkyscs@163.com

DOI：10.16861/j.cnki.zggc.202423.0652

摘    要：MYB转录因子是植物转录因子家族中数量最多、用途最广的成员之一，为挖掘更多番茄（Solanum lycopersicum）MYB转录因子家族成员信息，初步探究其表达模式及功能，以番茄Ailsa Craig为试材，采用RT-PCR的方法克隆SlMYB48基因，并对其进行生物信息学及表达、定位分析。结果表明，番茄SlMYB48基因的开放阅读框（ORF）长度为708 bp，编码235个氨基酸，在番茄的根中表达量最高，叶中次之。SlMYB48蛋白含有保守的MYB结构域，定位于细胞核中，属于不稳定、亲水性蛋白。对SlMYB48启动子分析，发现其含有大量的逆境响应元件，qRT-PCR及RNA-seq 数据库分析结果表明，高盐、生物逆境胁迫条件下，SlMYB48基因表达量均随处理时间延长而升高，干旱胁迫条件下表达量下降，推测其可能参与番茄生物及非生物逆境胁迫反应。研究结果为进一步深入探究番茄SlMYB48基因的功能及作用机制提供了参考。

关键词：番茄；SlMYB48；表达分析；定位

中图分类号：S641.2           文献标志码：A            文章编号：1673-2871（2024）04-027-09

Bioinformatics and expression analysis of tomato SlMYB48 gene

LIU Jiafeng1， GUO Xiaoqing2， WANG Guiqiang3， WANG Hongyun4， ZHU Tong1， CAO Shoujun4， YAO Jian’gang4， ZHANG Lili4， ZHANG Ruiqing4， ZHAO Jing1， LI Tao1， 4

（1. College of Life and Science， Yantai University， Yantai 264000， Shandong， China; 2. Yantai Agricultural Technology Extension Center， Yantai 265499， Shandong， China; 3. Agricultural Comprehensive Service Center， Zhangxing Town， Zhaoyuan 265403， Shandong， China; 4. Yantai Academy of Agricultural Sciences， Yantai 264500， Shandong， China）

Abstract： MYB transcription factor is one of the most abundant and widely used members of the plant transcription factor family. In order to mine more information about MYB transcription factor family members of tomato （Solanum lycopersicum） and preliminarily explore its expression pattern and function， this study took tomato Ailsa Craig as the test material. SlMYB48 gene was cloned by RT-PCR， and its bioinformatics， expression and localization were analyzed. The results showed that the open reading frame （ORF） length of tomato SlMYB48 gene was 708 bp， encoding 235 amino acids， and the expression level was the highest in tomato roots， followed by in leaves. The SlMYB48 protein contains a conserved MYB domain， which is an unstable， hydrophilic protein located in the nucleus . SlMYB48 promoter analysis found that it contained a large number of stress response elements. The results of qRT-PCR and RNA-seq database analysis showed that the expression of SlMYB48 gene increased with the extension of treatment time under high salt and biological stress， and decreased under drought stress， suggesting that SlMYB48 gene might be involved in biological and abiotic stress response of tomato. The results of this study provide a reference for further investigation of the function and mechanism of tomato SlMYB48 gene.

Key words： Solanum lycopersicum; SlMYB48; Expression analysis; Location

番茄（Solanum lycopersicum）具有良好的口感、丰富的营养、繁多的品种以及较高的研究价值和经济价值，成为我国乃至世界上栽培最为广泛的蔬菜作物之一。在生物学水平上，番茄也是应用于多种学科领域、进行遗传转化研究的非常重要的模式植物。自然环境中的高盐、干旱、低温等逆境因素严重影响番茄的生长发育和产量，因此了解番茄在抗逆反应过程中的作用机制，进而探寻抗逆基因资源、选育番茄抗逆品种在理论和生产上具有重大意义。

MYB转录因子是植物转录因子家族中数量最多、用途最广的成员之一[1]。MYB转录因子是基于编码蛋白含有一个或多个高度保守的DNA结构域-MYB结构域，含有大约50个氨基酸残基组成的不完全重复的R结构（R1，R2和R3）[2]。根据每个基因中R结构的数量，可分为4个亚类[3]。其中，R1/R2-MYB亚类只包含1个MYB结构域，R2R3-MYB亚类包含2个MYB结构域，R1R2R3-MYB亚类包含3个连续结构域，4R-MYB亚类包含4个MYB结构域[4-6]。

在植物中第一个被发现的MYB类基因是从单子叶植物玉米中克隆出来的ZmMYBC1基因，该基因为色素合成有关基因[7]。随着基因组学和分子生物学的发展，越来越多的MYB家族成员被鉴定。MYB转录因子不仅能对激素以及干旱、高温、高盐等逆境胁迫作出应答[8]，而且广泛参与植物初生和次生代谢反应[9]，并对植物的生长发育和形态建成[10]，具有重要的调控作用。MYB转录因子参与植物的生长发育调控，AtMYB23基因参与拟南芥根表皮发育过程中的正调控途径[11]。植物MYB类转录因子在植物的代谢生理活动中也发挥作用，玉米ZmMYB028和ZmMYB073成员与苯丙烷生物合成负调控相关[12]。已有研究表明，番茄MYB类转录因子在响应干旱胁迫方面发挥着重要作用。在干旱胁迫处理下，SlMYB10和SlMYB14两个基因相对表达量呈升高趋势，将SlMYB14基因沉默后，通过对生理生化指标以及活性氧的测定，表明SlMYB14基因对番茄耐盐性和抗旱性有重要作用[13]。沉默SlMYB71基因后，促进了番茄植株在干旱胁迫下的生长，降低了活性氧含量、相对电导率和丙二醛含量，影响叶绿素积累和胁迫基因的表达，表明SlMYB71基因在非生物胁迫方面起着负调控作用[14]。

笔者前期通过海水栽培番茄的转录组分析，发现随海水浓度增加，SlMYB48表达量升高[15]。为了进一步研究SlMYB48转录因子在番茄生长发育以及抗逆过程中的功能和机制，利用RT-PCR方法克隆了SlMYB48基因，并对其进行生物信息学、启动子响应元件、表达、定位等分析，以期为后续研究番茄SlMYB48基因的功能及作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用番茄品种为Ailsa Craig，种子由山东省烟台市农业科学研究院蔬菜花卉研究所保存。试验于2022年10月至2023年7月在山东省烟台市农业科学研究院蔬菜花卉研究所实验室进行。取新鲜的番茄叶片，锡箔纸包裹置于液氮中冷冻，并在-80 ℃保存，用于RNA提取。用于组织表达分析取样的部位及时期：叶为完全展开的功能叶；茎为生长点下端第2节位茎段；根为清洗后的白色根段；花朵为开放当天的花；成熟果为红色的正常健康果实。将番茄种子播种于20 cm×20 cm塑料盆中，栽培基质按草炭、蛭石、珍珠岩体积比2∶1∶1进行配置，在植株5叶1心期时，进行干旱胁迫和高盐胁迫处理，将200 mL10%的聚乙二醇6000 （PEG-6000）溶液、200 mL的NaCl溶液（200 mmol·L-1）分别灌溉番茄植株，在1、6、12、24、48、72 h分别取番茄叶片，液氮冷冻，-80 ℃保存，用于逆境胁迫表达分析。亚细胞定位所用植物材料为本氏烟草（Nicotiana benthamiana L.），将烟草种子播种于7 cm×7 cm穴盘中，光周期设置为光照12 h/黑暗12 h，在温度为（25±2） ℃光照培养箱中培养1个月，用于烟草瞬时转化。

RNA提取试剂盒购于北京华越洋生物科技有限公司；反转录试剂盒购于天根生化科技有限公司；高保真DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒和DNA回收试剂盒购于艾科瑞生物科技有限公司。其他化学药品购于北京聚合美生物科技有限公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链的合成 将番茄嫩叶用液氮研磨，按照华越洋RNA提取试剂盒操作说明提取植物组织总RNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，使用天根cDNA第一链合成试剂盒将其反转录获得cDNA，然后置于-20 ℃保存，用于后续试验。

1.2.2 番茄SlMYB48基因的克隆 从NCBI中获得番茄MYB家族基因成员SlMYB48的序列，利用Primer 5工具设计全长引物，引物序列为F：ATGGCACAAGAAGAAATGAGAAGAG；R：TTAGCCAGCAAAGAATGTGTTATCCT，以cDNA为模板，扩增SlMB48全长序列。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，51 ℃退火20 s，72 ℃延伸22 s，共40个循环，72 ℃延伸5 min。用2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切胶后使用华越洋DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，将扩增产物连接至pMD18-T克隆载体，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取经PCR鉴定的阳性克隆，送样测序。

1.2.3 SlMYB48基因生物信息学分析 在NCBI中利用Conservation Domain程序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ cdd/？term=）进行基因保守结构域分析。在ProtParam网站（https：//web.expasy.org/protparam/）计算蛋白的等电点、分子质量和分子式。运用TMHMM Server v. 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白的跨膜域预测；通过SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1）预测信号肽。利用ExPasy-ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）预测蛋白质亲水疏水性。利用SOPMA网站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa _automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）预测蛋白质二级结构。利用Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/）网站进行同源建模预测三级结构。在NCBI网站中利用blastn（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？ PROGRAM=blastn& PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）将SlMYB48基因与蛋白nr数据库比对。利用DNAMAN对各物种中的MYB的氨基酸序列进行比对。使用MEGA7软件的邻接法构建系统进化树。