基于SCoT分子标记的61份加工型黄瓜种质资源遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建

DOI：10.16861/j.cnki.zggc.202423.0760

摘    要：为探明加工型黄瓜种质资源的亲缘关系及遗传多样性，为新品种选育提供理论依据，采用目标起始密码子多态性标记（SCoT）技术，以61份加工型黄瓜种质资源为试验材料，进行遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱。结果表明，从100条SCoT引物中筛选出8条扩增条带清晰、多态性高且重复性好的引物；利用筛选出的引物对61份黄瓜种质基因组DNA进行PCR扩增，共扩增出238个位点信息，其中多态性位点227个，平均多态性位点百分比为95.38%；采用NTSYS-pc 2.1软件计算得出供试的61份材料间的遗传相似系数分布在0.588～0.920之间，遗传相似系数最小的材料分别是34号与55号，二者在瓜色、叶片形状及果实形状方面存在较大差异，说明两者亲缘关系最远。基于遗传相似系数对其进行UPGMA聚类分析和树状图绘制，在相似系数0.735处，可将其划分为7个类群，说明61份黄瓜种质材料背景存在差异，但多数地域来源相近、生境相似地区的种质被聚在同一类群。利用2对特异性较大的引物SCoT 12和SCoT 83构建的DNA指纹图谱可单独鉴别出61份黄瓜种质资源，该图谱可为黄瓜分类与鉴定提供科学依据。

关键词：黄瓜；SCoT分子标记；亲缘关系；遗传多样性；DNA指纹图谱

中图分类号：S642.2           文献标志码：A                     文章编号：1673-2871（2024）04-036-10

Genetic diversity analysis and DNA fingerprinting construction of 61 processed cucumber germplasm resources based on SCoT markers

WANG Hongli1， ZHAO Jiucheng1， LAI Miao1， LU Jiashi2， LING Qichang1， XIAO Jinhua3， ZHANG Hua4， FU Xinfeng1

（1.Qinzhou Branch of Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Qinzhou Institute of Agricultural Sciences， Qinzhou 535000， Guangxi， China; 2. Institute of Flowers， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning  530007， Guangxi， China; 3. Agricultural and Rural Service Center of Napeng Town， Qinnan District， Qinzhou 535015， Guangxi， China; 4. Agriculture and Rural Service Center of Beitong Town， Pubei County， Pubei 535321， Guangxi， China）

Abstract： In order to find out the genetic diversity of germplasm resources of processed cucumber and provide theoretical basis for the breeding of new varieties. the genetic diversity of 61 processed cucumber germplasm resources was analyzed and DNA fingerprinting was constructed using SCoT technique. The results showed that 8 primers with clear amplification bands， high polymorphism and good repeatability were selected from 100 SCoT primers. A total of 238 loci of 61 cucumber germplasm genomic DNA were amplified by PCR using the selected primers， of which 227 were polymorphic loci， and the average percentage of polymorphic loci was 95.38%. NTSYS-pc 2.1 software was used to calculate the distribution of genetic similarity coefficients among the 61 tested materials between 0.588 and 0.920， and the material with the smallest genetic similarity coefficients was 34 and 55， respectively. There were great differences in melon color， leaf shape and fruit shape， indicating that the two were most loosely related. Based on the genetic similarity coefficient， UPGMA cluster analysis and tree diagram were performed. At the similarity coefficient 0.735， they could be divided into 7 groups. The results indicated that 61 cucumber germplasm material backgrounds were different， but most of the germplasm sources were similar， and germplasm from similar habitats were grouped together in the same group. Sixty-one cucumber germplasm resources could be identified by DNA fingerprinting of SCoT 12 and SCoT 83， which could provide scientific basis for classification and identification of cucumber.

Key words： Cucumber; SCoT molecular marker; Genetic relationship; Genetic diversity; DNA fingerprinting

收稿日期：2023-12-07；修回日期：2023-12-22

基金项目：广西壮族自治区科技先锋队“强农富民”“六个一”专项行动项目（桂农科盟 20230505）

作者简介：王宏利，男，农艺师，研究方向为黄瓜、百香果栽培及育种。E-mail：whl@gxaas.net

通信作者：付鑫锋，男，高级农艺师，主要从事黄瓜、百香果栽培与育种研究工作。E-mail：xfengf@gxaas.net

黄瓜（Cucumis sativus L.）是世界上主要蔬菜之一，也是我国保护地栽培面积最大的蔬菜作物，含有丰富的矿质营养和维生素，具有较高的食用价值、营养价值和药用价值，深受消费者的喜爱[1]。加工型黄瓜指主要用于腌制加工的黄瓜，以白皮或黄皮黄瓜为主，特点是瓜条顺直油亮、大小中等、色泽好。广西北部湾地区种植加工型黄瓜历史悠久，桂南地区的钦州市、北海市以得天独厚的自然条件，加工黄瓜种植面积常年维持在1万 hm2以上，其中尤以钦州市最具规模，种植面积占比可达70%。由于用于腌制加工的黄瓜没有专用品种，生产上主栽品种以农家自留种为主，造成多数种质资源的遗传背景不明确，品种同质化严重。且随着复种指数的提高，传统种植区域连作障碍凸显，退化变异严重，导致雌花率低、产量低、品相差、抗病性弱等问题突出，严重制约了加工型黄瓜产业的健康可持续发展。因此，建立快速有效的加工型黄瓜种质资源创新评价体系，发掘优异基因，是亟待解决的关键问题。

黄瓜新品种培育一般通过形态学鉴定，从大量种质资源中选择具有优良性状的亲本，通过杂交的方式培育新品种。黄瓜属于雌雄同株异花授粉植物，杂交后代中存在着较多的遗传变异，因此，只采用形态学、细胞学等传统方法分析黄瓜的遗传结构及亲缘关系具有一定的局限性，也无法直接全面解释其所具有的遗传多样性。随着分子标记技术的出现和发展，极大地加速了植物科学分子层面的研究，多种标记已被广泛用于作物种质遗传多样性研究[2]，为更好地研究黄瓜分子作用机制提供了新方法、新思路。目前，已有多种分子标记在黄瓜上得到了应用。Sahoo等[3]以11对ISSR引物对14个黄瓜基因型进行分子鉴定和遗传多样性分析，结果表明，14个黄瓜基因型间遗传相似性介于0.36～0.83之间，种间差异较大；Manohar等[4]使用23条RAPD引物和18条ISSR引物对印度卡纳塔克邦39份黄瓜种质资源的遗传多样性进行分析，筛选出CSC 83和CSC 71两份优质材料；Innark等[5]使用20个ISSR标记对40份黄瓜种质资源进行分析，系统发育树和主成分分析揭示黄瓜霜霉病与种质来源存在相关性；Mliki等[6]使用RAPD标记对来自阿尔及利亚、埃及、埃塞俄比亚、肯尼亚和利比亚等5个非洲国家的26份黄瓜种质资源的遗传多样性进行分析，认为类群一中的埃及种质具有独特的遗传变异；刘亚婷等[7]以48份黄瓜种质资源为材料，利用SRAP分子标记对其进行鉴定，得出了形态学标记和SRAP分子标记的聚类结果存在较大差异的结论。姚丹青等[8]利用SNP标记对市场上销售的71份黄瓜品种进行遗传多样性分析，证明30个SNP位点的基因分型数据信息可以将71份黄瓜品种区分开来；史建磊等[9]以48份黄瓜自交系为试材，利用37对SSR引物对其进行聚类分析和指纹图谱构建，以探究华南型黄瓜种质的遗传多样性及亲缘关系。目标起始密码子多态性标记（start codon targeted polymorphism，SCoT）由Collard等于2009年首次提出，是近年来广泛用于种质鉴定和亲缘关系分析的新型分子标记，具有稳定性强、多态性高、成本低廉及引物通用性高等优势，在葡萄、核桃、铁皮石斛、柠檬等多种经济作物中得到了应用[10-14]，但在加工型黄瓜中尚未见到此类报道。笔者以加工型黄瓜主产区广西钦州市及从山东省青岛市、福建省福州市和厦门市等地收集来的61份优质种质资源作为研究对象，首次在加工型黄瓜上使用SCoT分子标记进行种质资源遗传多样性分析和亲缘关系鉴定，旨在从分子生物学水平揭示加工型黄瓜种质资源遗传多样性信息，以期为加工型黄瓜种质资源分类、鉴定、保护和开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

笔者从广西钦州市、山东青岛市及福建福州市和厦门市等黄瓜种植基地收集了61份加工型黄瓜种质材料，于2023年2月10日在广西钦州市农业科学研究所久隆试验基地种质资源圃内进行穴盘（72孔，53 cm×27 cm）育苗，后移植于温室大棚内，每份材料各定植20株，定植间距50 cm，垄台高度15 cm，定植后，浇足定植水后3 d内禁止浇水，3 d后浇1次缓苗水，温室大棚内白天温度控制在24～28 ℃，晚上温度控制在13～15 ℃。在黄瓜结瓜期，每份材料采集植株嫩叶，液氮速冻后-80 ℃保存。黄瓜种质来源地及田间表型性状特征见表1。

1.2 黄瓜材料DNA基因组提取

使用天根多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN，Germany）从上述冻存的61份黄瓜叶片样本中分别提取10 μg总DNA，以DNA浓度、纯度及完整性为主要参考指标，使用Agilent2100 bioanalyzer对其进行质检，质检合格后，于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 引物筛选及SCOT-PCR扩增

试验采用由北京擎科生物科技有限公司合成的100对SCoT通用引物序列，选用表型性状差异较大的黄瓜种质DNA对其进行筛选，以扩增条带清晰、多态性高、稳定性强为标准，筛选出特异性好质量高的引物对所有供试样品进行PCR扩增。PCR扩增体系为上下游引物（10 μmol·L−1）各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，2×SG Green qPCR Mix 10.0 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 7.8 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火15 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸5 min，共35个循环。扩增产物放置于4 ℃冰箱中保存。取10 μL PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用Bio-Rad全自动免染凝胶成像分析系统进行扫描拍照。