西瓜ClKNOX基因家族全基因组鉴定及组织表达分析

摘    要：KNOX基因家族是编码同源异型盒蛋白的转录因子，在植物生长发育和胁迫响应中发挥着重要的调控作用。为进一步挖掘西瓜KNOX转录因子家族成员信息，探究分析其表达模式及基因功能，通过生物信息学方法对西瓜KNOX基因家族成员进行了鉴定，并对其理化性质、基因结构、系统进化及表达模式进行了分析。结果表明，西瓜基因组中共有12个KNOX基因，均定位于细胞核中，符合转录因子属性特征；KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox_KN这4类典型结构域均存在于大多数西瓜KNOX基因中，表明这4类结构域在KNOX基因功能中具有重要作用；系统发育分析将ClKNOX基因家族成员分为Class Ⅰ A、Class Ⅰ B、Class Ⅱ A和Class Ⅱ B 4个亚组，启动子元件分析表明，ClKNOX基因家族含有较多与生长发育和胁迫响应相关的顺式作用调控元件；组织表达分析结果表明，ClKNOX基因具有明显的组织特异表达特性，ClKNOX6和ClKNOX11在根和茎中高表达，而ClKNOX3和ClKNOX10在所有器官中表达量都相对较高，但所有ClKNOX基因在果肉中的相对表达量都较低。研究结果为进一步深入探究ClKNOX基因在生长发育中的功能和组织表达特性奠定了基础。

关键词：西瓜；KNOX基因家族；全基因组鉴定；生物信息学分析；组织表达

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）05-018-10

Genome-wide identification and expression analysis of ClKNOX gene family in watermelon

CHEN Yaxin， HU Aofeng， ZHANG Liming， LIU Quanquan， YANG Luming， ZHU Huayu， LIU Dongming

（Horticulture College of Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046， Henan， China）

Abstract： KNOTTED-like homeodomain（KNOX）gene family is a class of transcription factors encoding homeobox protein， which plays an important role in plant growth and stress responses. To further investigate the watermelon KNOX transcription factor family members， the bioinformatics methods was utilized to identify and analyze their physical and chemical properties， gene structure， phylogeny， and expression patterns. The study revealed the presence of 12 KNOX genes in the watermelon genome， all of which were identified in the nucleus， the result was consistent with their characteristics as transcription factors. Most KNOX genes in watermelon exhibited the typical domains KNOX1， KNOX2， ELK， and Homeobox_KN， suggesting the significance of these domains in KNOX gene functionality. Phylogenetic analysis categorized ClKNOX gene family members into four subgroups： ClassⅠA， ClassⅠB， ClassⅡA， and ClassⅡB. Analysis of promoter elements indicated that the ClKNOX gene family harbored numerous cis-acting regulatory elements associated with growth， development， and stress response. The results of tissue expression analysis revealed distinct patterns for ClKNOX gene expression. Specifically， ClKNOX6 and ClKNOX11 exhibited high expression levels in roots and stems， whereas ClKNOX3 and ClKNOX10 showed relatively high expression across all organs. However， all ClKNOX genes had low relative expression levels in flesh. These findings provide a basis for future investigations into the functional roles and tissue-specific expression patterns of ClKNOX genes in growth and development.

Key words： Watermelon; KNOX gene family; Genome-wide identification; Bioinformatics analysis; Tissue expression

西瓜[Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum. and Nakai]为葫芦科西瓜属一年生蔓生草本植物，富含多种维生素和对人体有益的瓜氨酸、番茄红素等营养成分，无论鲜食还是制成果汁、糖果或蘸酱等都深受世界各地消费者的喜爱。同源异型盒基因家族（homeobox gene family）在动物和植物发育调控中具有重要作用，该基因家族包含高度保守的180个碱基对，编码一个含有60个氨基酸的三螺旋结构域，最早被克隆的homeobox基因来自果蝇[1]，随后植物中第一个homeobox基因——Knotted-1在玉米中被分离获得[2]。近年来研究发现，该基因家族广泛存在于陆生植物类群和特定的绿藻门植物中，但在红藻植物中尚未被发现[3-4]。根据是否含有一个三氨基酸的环延伸基序，homeobox类基因被分为TALE和non-TALE两类[5]，在动物中已经鉴定出4种类型的TALE基因，分别为MEIS、IRO、TGIF和PBC，而在植物中仅有KNOX（KNOTTED-like homobox）和BELL（BELL-like）两类基因被鉴定[6]。KNOX类基因通常含有4个典型结构域，分别为负责识别下游靶基因启动子序列的C端同源结构域 （Homeobox_KN）、N端的KNOX1和KNOX2以及参与转录抑制核定位信号、促进蛋白质-蛋白质相互作用的ELK结构域。由于MEIS和KNOX家族基因结构相似，KNOX1和KNOX2结构域也称为MEINOX结构域，在他们的同源盒中，在第一和第二螺旋之间还有3个额外的氨基酸 （P-Y-P）[6-7]，该类结构域参与抑制靶基因表达和同二聚化。

根据序列相似性、内含子位置、系统发育关系和表达特点，KNOX类基因常分为I类、II类和M类[4，8-9]。I类亚家族包括SHOOT MERISTEMLESS （STM）、KNAT1、KNAT2和KNAT6 等4个成员。作为转录激活因子或抑制因子，I类亚家族基因在分生组织发育、叶形状的控制、激素稳态方面发挥重要作用，常在茎顶分生组织中表达[3]。STM基因在茎顶端分生组织中负责维持并调节花序结构，KNAT1在拟南芥根中也显示出细胞特异性表达模式[10]，并与STM类基因具有冗余性[11-13]。KNAT2在茎顶端分生组织和根组织中表达[14-15]，而KNAT6在胚胎茎顶端分生组织、茎顶端分生组织边界[14]和根韧皮部组织中表达[16]。II类亚家族基因中，KNAT3、KNAT4和KNAT5在拟南芥根中显示出细胞特异性表达模式[11]。KNAT3在幼果、花序和根中表达量最高，而KNAT4在叶片和幼果中表达量最高[17]。KNAT5在幼芽和根新发育的伸长区表达，在表皮中的表达可用来标记细胞分裂和伸长的边界[11]。KNAT7在拟南芥根的中央部位高度表达[18]，在拟南芥和杨树中与次生壁形成有关[19]。M类亚家族包含KNATM基因，在叶片近端-远端模式中起作用，并在成熟器官边界的器官原基近侧域中表达[9]。

我国西瓜种植面积和产量常年居世界第一位[20]。近年来，随着分子生物学技术的不断发展和西瓜参考基因组数据的不断优化，以精准定向聚合优异基因的分子育种已成为西瓜育种技术的主要发展方向。明确重要性状调控基因是实现从传统常规育种向分子标记辅助育种转型的基础。KNOX家族基因具有组织特异性表达的特点，且在植物器官发育调控中具有重要作用。目前KNOX家族基因在葫芦科作物中的报道仅局限于黄瓜和瓠瓜，在黄瓜中有研究表明，KNOX家族基因TKN2和TKN4与APRR2表达模式一致，推测其可能共同调控黄瓜叶绿体代谢机制[21]。在瓠瓜上已经进行了KNOX全基因组水平的鉴定和组织表达分析[22]，而针对西瓜还未有系统的研究报道。笔者在全基因组水平上对西瓜KNOX基因家族成员进行了鉴定分析，共筛选获得了12个西瓜KNOX基因，对其理化性质、亚细胞定位、系统进化树、染色体定位和启动子元件进行了分析，并选用遗传性状稳定的西瓜材料WT2来探究其组织表达模式，以期为进一步了解KNOX的进化特征和功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验材料西瓜高代自交系WT2，由河南农业大学园艺学院瓜类作物基因组与分子育种实验室收集保存，性状稳定遗传。试验于2023年5－11月在河南农业大学园艺学院瓜类作物基因组与分子育种实验室进行。

取籽粒饱满的WT2西瓜种子，55 ℃温汤浸种催芽后播种于穴盘中，放置在人工气候箱（28 ℃，16 h光照/8 h黑暗，相对湿度70%）内。于3叶1心时定植在温室大棚中，并合理实施浇水施肥、病虫害防治等栽培管理措施，开花期严格自交授粉。授粉后28 d分别取根、茎、叶、花、果皮和果肉等组织部位，采用随机区组法进行取样，每个样本设置3次重复。所有样品用锡箔纸包裹后放于液氮中速冻，随后存放于-80 ℃超低温冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 ClKNOX基因家族成员的鉴定和理化性质预测 西瓜参考基因组、蛋白序列及注释文件均来自葫芦科基因组数据库（http：//cucurbitgenomics.org/organism/21），采用97103-V2版本数据[23]。拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）参考基因组、蛋白序列、注释文件及KNOX基因家族成员数据均下载自TAIR网站（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）。KNOX基因家族结构域的隐马尔科夫模型文件下载于pfam数据库 （http：//pfam.Xfam.org/）[24]。为获得准确的ClKNOX基因鉴定信息，首先在pfam数据库下载KNOX基因家族结构域的隐马尔科夫模型文件，使用hmmer软件对西瓜蛋白数据库进行比对搜索[25]；然后以拟南芥KNOX蛋白序列为探针，在西瓜基因组数据库进行搜索。将以上两种方法获得的KNOX蛋白序列在NCBI-CDD网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 进行保守结构域鉴定，得到含有KNOX结构域的候选蛋白[26]。利用在线工具ProtParamtool （https：//web.expasy.org/protparam/）分析西瓜KNOX家族成员的氨基酸数目、蛋白分子质量、等电点等理化特性[27]。利用Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）预测各基因的亚细胞定位[28]。