西瓜噬酸菌DeoR家族转录因子glpR的功能研究

摘    要：DeoR（Deoxyribonucleoside operon repressor）家族转录因子是在原核生物中广泛存在的转录调控因子。DeoR通过调节毒力因子的表达来影响病原细菌的致病性，并且在不同的病原细菌中有不同的调控网络。为了阐明DeoR在西瓜噬酸菌中的功能和信号通路，Aac5菌株被用来构建DeoR转录因子glpR的缺失突变株及互补菌株，通过进行表型及转录水平的测定，对西瓜噬酸菌中DeoR转录因子glpR的功能进行初步探究。结果表明，缺失glpR基因后，Aac5菌株利用果糖的能力、对西瓜苗的致病能力、西瓜子叶体内生长能力以及形成生物膜的能力均显著下降，体外生长速度减慢，而抗高盐胁迫能力以及抗铜离子胁迫能力显著增强。同时，基因glpR的缺失会导致三型分泌系统基因hrpG、hrpE及hrcJ表达量显著下调，果糖利用相关基因fruA、fruB与fruK表达量显著下调，生物膜相关基因flgG表达量显著下调，与WT-fruBpGUS相比，ΔglpR-fruBpGUS的fruB的启动子活性显著减弱。以上结果表明，glpR基因在西瓜噬酸菌果糖利用、抵抗逆境胁迫以及致病过程中起重要作用。

关键词：西瓜噬酸菌；致病力；DeoR转录因子

中图分类号：S651+Q945.8 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）05-041-12

Function of DeoR family transcription factor glpR in Acidovorax citrulli

WANG Chengliang1， 2， QIAO Pei2， LIU Dehua1， 2， MENG Yonghong3， GUAN Wei2， YANG Yuwen2， 4， ZHAO Tingchang2， 4

（1. College of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jilin， China; 2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Beijing 100193， China; 3. Ledong Douzhiguo Melon and Watermelon Planting Professional Farmers Cooperative， Ledong 572541， Hainan， China; 4. National Nanfan Research Institute（Sanya）， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Sanya 572024， Hainan， China）

Abstract： The DeoR（Deoxyribonucleoside operon repressor） family of transcription factors are transcriptional regulators that are widely present in prokaryotes. DeoR affects the pathogenicity of pathogenic bacteria by regulating the expression of virulence factors， and there are different regulatory networks in different pathogenic bacteria. In order to elucidate its function and signaling pathway in Acidovorax citrulli， Aac5 strain was used to construct the deletion mutant and complementary strain of DeoR transcription factor glpR. The function of DeoR transcription factor glpR in Acidovorax citrulli was preliminarily explored by measuring the phenotype and transcription level. The results showed that after deletion of glpR gene， the ability of Aac5 strain to utilize fructose， the pathogenicity of watermelon seedlings， the growth ability of watermelon cotyledons and the ability to form biofilm were significantly decreased， and the growth rate in vitro was slowed down. The ability to resist high salt stress and copper ion stress was significantly increased. At the same time， the deletion of the gene glpR resulted in a significant down-regulation of the type III secretion system genes hrpG， hrpE and hrcJ， a significant down-regulation of the fructose utilization-related genes fruA， fruB and fruK， and a significant down-regulation of the biofilm-related gene flgG. Compared with WT-fruBpGUS， the promoter activity of fruB in ΔglpR-fruBpGUS was significantly reduced. The results indicated that glpR gene plays an important role in fructose utilization， resistance to stress and pathogenicity of Acidovorax citrulli.

Key words： Acidovorax citrulli; Virulence; DeoR transcription factor

细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是典型的检疫性细菌性病害，会对西瓜、甜瓜等葫芦科作物造成严重危害，西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）为其病原菌。根据寄主的差异可以将西瓜噬酸菌划分为两组，I组菌株、II组菌株分别主要分离自甜瓜、西瓜[1-2]。1965年该病首次在美国佐治亚州被发现[3]，目前已在世界范围内发生流行。在西瓜噬酸菌中研究比较多的发挥重要作用的致病因子主要有Ⅲ型分泌系统[4-6]、IV型菌毛[7]、Ⅵ型分泌系统[8]、鞭毛[9]、群体感应[10]以及生物膜等[11]，但是该病害在致病机制方面的研究仍然较少，针对性的防控手段也比较有限[12-13]，因此通过解析该病害的致病机制可为开发新的防控果斑病技术提供参考。

果糖是细菌碳水化合物代谢途径早期进化中的重要糖类，果糖代谢在生命活动中具有重要意义，并且果糖磷酸转移酶系统（PTSFru）在细菌物种中比任何其他碳水化合物磷酸转移酶系统都更广泛[14]。果糖磷酸转移酶系统由fruA和fruB组成，细菌先通过果糖磷酸转移酶系统将果糖运输并磷酸化为果糖-1-磷酸，然后通过fruK编码的1-磷酸果糖激酶把果糖-1-磷酸磷酸化为果糖-1，6-二磷酸。因此，fruA、fruB和fruK是果糖代谢过程中的关键基因[15]。

DeoR（Deoxyribonucleoside operon repressor）家族转录调控因子广泛存在于细菌中，该家族首个被鉴定的成员是大肠杆菌（Escherichia coli）DeoR蛋白，是一种调控deo操纵子（deoxyribonucleoside operon）转录表达的转录抑制子[16-18]。DeoR蛋白单体在结构上主要由N末端DNA结合结构域和存在于C末端的配体结合结构域组成，并且有一个保守的螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）结构基序存在于N端DNA结合结构域中[19-20]，C末端结构域的用途是完成蛋白寡聚化和配体结合[21]。而在功能上，大肠杆菌DeoR蛋白既可作为局部的特异性调控因子[22-23]，也可作为全局的多效性调控因子[24-25]，还可以通过结合启动子DNA的特定序列来转录抑制或者激活靶基因的转录表达[26]。

目前已发现多个DeoR转录因子在细菌致病过程、果糖代谢和抗胁迫过程中发挥着重要作用。笔者在本研究中，通过对西瓜噬酸菌 AAC00-1 基因组生物信息学分析，只发现了1个DeoR家族转录因子glpR，但是DeoR家族转录因子在西瓜噬酸菌致病过程中的功能尚不清楚，因此，笔者通过敲除西瓜噬酸菌glpR基因来探究其对西瓜噬酸菌致病相关多种表型以及转录水平的影响，从而明确glpR基因在西瓜噬酸菌中的功能，为西瓜噬酸菌中DeoR家族转录因子相关调控网络的后续探索提供参考，也为细菌性果斑病有效防治技术的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物、菌株与质粒 试验于2022年6月至2023年8月在中国农业科学院植物保护研究所进行。试验所用西瓜（Citrullus lanatus）品种为中蔬瑞鑫[中蔬种业科技（北京）有限公司]。本试验所用菌株及质粒详见表1。

大肠杆菌在溶菌肉汤（Lysogeny broth，LB）培养基中37 ℃、220 r·min-1振荡培养；西瓜噬酸菌Aac5、ΔglpR和ΔglpRcomp使用金氏B（King’s B，KB）培养基28 ℃、220 r·min-1培养。卡那霉素（Kanamycin，Km）、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）、氯霉素（Chloraphenical， Cm）的终质量浓度分别为50、100、25 μg·mL-1。

1.1.2 试剂、培养基 试剂：限制性内切酶和KOD高保真酶购自日本TaKaRa公司，质粒小提试剂盒购自美国Axygen生物有限公司，SuperReal PreMix Plus（SYRB Green）购自北京天根生化科技有限公司，细菌总RNA提取试剂盒购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司等。由北京六合华大基因科技有限公司完成测序以及相关引物合成。

培养基－（1）KB培养基（pH 7.0）：参考蔡馥宇等[27]的配方；（2）LB培养基（pH 7.0）：参考蔡馥宇等[27]的配方；（3）0.3%半固体培养基[28]（pH 7.0）：细菌专用蛋白胨0.24 g、运动性专用琼脂粉2.4 g以及酵母粉0.24 g，分别使用去离子水将上述3种培养基定容至800 mL，灭菌温度和时间分别为121 ℃、20 min，灭菌后放室温备用。（4）三型分泌系统（Type III Secretory System，T3SS）诱导培养基XVM2：果糖1.801 g、MgSO4 0.601 g、KH2PO4 0.021 7 g、酪蛋白水解物0.3 g、蔗糖3.432 g、（NH4）2SO4 1.33 g、CaCl2 1.11 g、FeSO4·7H2O 0.002 8 g、NaCl 1.17 g以及K2HPO4·3H2O 0.073 g，最后调至pH=6.7[29]；（5）M9培养基（pH 7.0）：KH2PO4 9 g、Na2HPO4·12H2O 45.362 1 g、NaCl 1.5 g以及NH4Cl 3 g[30]；（6）MMX基础培养基（pH 7.0）：KH2PO4 6 g、柠檬酸三钠1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO4 4 g、葡萄糖5 g、（NH4）2SO4 1.33 g[31]。（7）MMX-q培养基则是在MMX基础培养基基础上，将该培养基中的糖源葡萄糖改为果糖。将上述4种培养基均加入去离子水至1000 mL，在110 ℃条件下高压灭菌15 min后备用。