Wus2和IPT转基因番茄类愈伤组织的转录组分析

摘    要：以AC（Ailsa Craig）番茄为材料，采用Fast-TrACC（fast-treated agrobacterium co-culture）农杆菌转化体系，利用RNA-Seq测序和荧光定量PCR技术，比较了转化DRs（Wus2和IPT）形成的类愈伤组织与普通下胚轴之间的基因表达差异。基因表达结果分析表明，有60个差异表达基因在激素信号转导通路中富集，其中上调表达基因34个，下调表达基因26个；体细胞胚形成关键基因ECP63、AGL15、FUS3、ABI3、WUS和CUC2上调表达超过4倍；ENOD93和CKX2基因在类愈伤组织中的表达量上升超过1000倍，前者编码早期结瘤素蛋白ENOD93，后者编码细胞分裂素氧化酶2，用于催化细胞分裂素的降解，参与氮同化和光合作用的基因低表达。研究结果可为深入解析番茄类愈伤组织发生的分子机制和发掘关键调控基因奠定基础，为番茄活体体内转化提供理论依据。

关键词：番茄；植物内转化；RNA-Seq；类愈伤组织；发育因子

中图分类号：S641.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）06-027-10

Transcriptome analysis of transgenic tomato callus tissues from Wus2 and IPT

HE Xinxin， HUANG Jiaquan

（School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University/Sanya Nanfan Research Institute of Hainan University， Sanya 572025， Hainan， China）

Abstract： AC（Ailsa Craig）tomato （Solanum lycopersicum L.） was used as the experimental material and the Fast-TrACC（fast created Agrobacterium co culture）Agrobacterium transformation system was used in this study. RNA-Seq sequencing and fluorescence quantitative PCR technology were used to compare the gene expression differences between the callus-like tissues formed after transforming DRs（Wus2 and IPT）and the common hypocotyls. The analysis of gene expression results showed that 60 differentially expressed genes were enriched in the hormone signal transduction pathway， including 34 upregulated genes and 26 downregulated genes. The key genes for somatic embryo formation， ECP63， AGL15， FUS3， ABI3， WUS， and CUC2， are upregulated by more than 4-fold expression; the expression levels of ENOD93 and CKX2 genes in callus-like tissues increased by more than 1000 times. The former encodes the early nodulin protein ENOD93， while the latter encodes cytokinin oxidase 2， which catalyzes the degradation of cytokinin. Low expression of genes involved in nitrogen assimilation and photosynthesis. The research results can lay a foundation for a better understanding of the molecular mechanism of tomato callus-like tissues formation and the discovery of key regulatory genes， providing a theoretical basis for tomato in plant transformation.

Key words： Tomato; In-planta transformation; RNA-Seq; Callus-like tissue; Development regulators

遗传转化是分析基因功能的重要手段，也是获得新材料的重要途径。根癌农杆菌介导的遗传转化是植物中应用最为广泛的遗传转化方法[1-2]，根癌农杆菌能够侵入植物细胞并将携带外源基因的T-DNA整合到植物基因组中遗传给后代，实现外源基因的遗传转化。通常，根癌农杆菌介导的遗传转化需要与植物组织培养结合，耗时较长，步骤多，基因型依赖且影响转化效率的因素较多。植物内转化能减少或避免外源植物激素的使用，减轻植物细胞的伤害及变异，提高转化效率，扩大受体系统的应用范围，并能确保引入的基因更好地适应环境，在植物中稳定表达，因此该方法近年来已成为研究的热点。但是对大部分植物而言，植物内转化仍存在转化效率不高、受植物生理状态影响和可重复性差等问题。

研究发现，一些植物发育调节因子（developmental regulators，DRs），如WUSCHEL（WUS）、ISOPENTYLTRANSFERS（IPT）、BABY BOOM（BBM）、STM、WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1（WIND1）的表达能够诱导特定的发育程序，从而决定分生组织的分化方向。WUS在分生组织干细胞中心表达，能维持干细胞活性，保持干细胞处于未分化状态。WUS转录因子能通过胞间连丝移动到干细胞中[3]，调节目标位点的组蛋白乙酰化，控制生长素信号传导和反应途径，使生长素在局部积累并启动细胞分化[4]。WUS的同源基因Wus2编码一种同源异型结构域蛋白，参与顶端分生组织的维持[5]。Wus2能直接诱导高粱、玉米、烟草等植物体细胞胚的形成和再生[6-8]。IPT编码的IPT酶是一种异戊烯基转移酶，能够催化异戊烯基焦磷酸和单磷酸腺苷分解产生异戊烯基单磷酸腺苷。IPT酶被认为是高等植物细胞分裂素生物合成的限速酶[9]，在植物芽形成中起关键作用。在苹果中过表达MdIPT1可使其愈伤组织在缺乏细胞分裂素的培养基上保持活力[10]。拟南芥的3个IPT基因家族成员（AtIPT7、AtIPT8和AtIPT9）均可促进胚性愈伤组织形成和芽再生[11-12]。Maher等[8]利用双生病毒载体，高表达不同的DRs组合，通过分生组织从头诱导的方式实现了烟草幼苗的植物内转化，并将外源基因传递给了下一代。然而，DRs促进类愈伤组织形成以及芽分化的分子途径还不清楚。在本研究中，以番茄为材料，通过转录组测序分析研究了类愈伤组织中基因的差异表达，以探究在DRs表达的条件下类愈伤组织形成的机制，为进一步提高植物内转化效率和实现多种作物的植物内转化提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 番茄材料是Ailsa Craig（AC），由海南大学陈银华老师赠予，本课题组（热带特色果树团队）留种扩繁。

1.1.2 其他材料 载体pMKV057在Daniel Voytas实验室购买，其T-DNA区域携带菜豆矮缩病毒（bean yellow dwarf virus）复制子，用于表达 FireKy Luc+、Wus2和IPT。大肠杆菌GV3101在上海唯地生物技术有限公司购买。FireKy Luc+的引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，正向引物序列为 5'- GAGATACGCCCTGGTTC -3'，反向引物序列为 5'- GCGGTTGTTACTTGACTGG -3'，2个引物间的片段长度为1434 bp。细菌质粒的DNA用SanPre Column PlASmid Mini-Preps Kit（生工生物工程股份有限公司）提取，番茄DNA用SteadyPure通用型基因组DNA提取试剂盒（艾科瑞生物工程有限公司）提取。

1.2 方法

试验时间为2021年9月至2024年6月，地点是海南大学农科楼东副南楼311实验室。

1.2.1 番茄转化方法 将450粒番茄种子在清水中浸泡20 min，50 ℃恒温水浴30 min，4 ℃静置5 h。然后用70%酒精消毒1 min，清水清洗4次，在超净台上用8%的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸去种子表面多余的水分后，接种于1/2 MS固体培养基（pH 5.7）上（图1-A），25 ℃暗培养3 d，然后转移至光照培养箱（25 ℃，湿度70%，16 h/8 h光暗周期），种子约1周萌发。

用含有目的基因的质粒转化根癌农杆菌GV3101并验证后，将根癌农杆菌涂布于含有3种抗生素（50 mg·L-1 kan、50 mg·L-1 rif、40 mg·L-1 gent）的YEB平板上，28 ℃暗培养1 d。收集菌体，重悬于AB∶MES（3 g·L-1 K2HPO4，1 g·L-1 Na2HPO4，1 g·L-1 NH4Cl，0.31 g·L-1 MgSO4·7 H2O，10.66 g·L-1 MES，20 g·L-1葡萄糖，0.1491 g·L-1 KCl，0.0111 g·L-1 CaCl2，0.0015 g·L-1 FeSO4，pH 5.7）溶液中，加入200 μmol·L-1乙酰丁香酮（AS），使菌液OD600=0.3，28 ℃摇菌过夜。离心收集农杆菌，重悬于含AB∶MES和1/2 MS的（1∶1，V/V）的混合液中，加入200 μmol·L-1的AS和0.01%的Silwet L-77，使工作菌液OD600=0.10～0.18。

选择400株具有2片子叶的番茄无菌苗，浸泡在含有工作菌液的150 mL锥形瓶中，轻轻摇晃15 min，倒掉多余液体后，将番茄苗放置在25 ℃培养箱中暗培养2 d（图1-B）。用无菌水冲洗番茄苗，无菌滤纸擦干，挑选子叶完整的100株番茄苗，移至装有1/2 MS选择培养基（含有300 mg·L-1特美汀，150 mg·L-1头孢霉素）的组培瓶中，3次重复，每个组培瓶中5株番茄苗，放置在光照培养箱中（25 ℃，湿度70%，16 h/8 h光暗周期），每周更换1次培养基。2周后，番茄幼苗下胚轴膨大，形成类愈伤组织（图1-C），这时大部分类愈伤组织保持不分化的状态，小部分类愈伤组织分化出芽。将不定芽切下转移至新的1/2 MS培养基上，放在光照培养箱中培养，每2 d继代1次。部分芽能正常生长（图1-D）。

1.2.2 转基因阳性植株的验证 随机选择3株转化后的番茄，按照DNA提取试剂盒的说明步骤提取其类愈伤组织的DNA进行PCR鉴定，阳性对照为提取的含目的基因的根癌农杆菌质粒，阴性对照为不含目的基因的根癌农杆菌侵染后的番茄下胚轴。PCR 反应体系为10 μL，包括2 μL ddH2O、5 μL 2×Rapid Taq Master Mix、1 μL上游引物、1 μL下游引物和1 μL提取的DNA。PCR的反应程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s、48 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s为1个循环，进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。