果型和抗性基因协同对番茄黄化曲叶病毒带毒量的影响
作者: 米国全,唐艳领,马凯,张春奇,蔡毓新,荆艳彩,牛莉莉,李红波,朱永,陈绘利,史宣杰
摘 要:以12份番茄种质为试材,其具有2类果实大小和3种不同抗性基因,通过检测番茄黄化曲叶病毒病田间抗性和带毒量指标,探索果实大小、抗病基因与田间抗性、带毒量之间的关系。结果显示,在自然传毒情况下,所有番茄材料都能检测到病毒感染。在番茄定植后28 d,小果型番茄M8(I)、M5(I)、M3(I)、M7(I)、M9(I)和M11(HR)带毒量均较低,大果型番茄M6(S)、M10(S)、M4(S)和M2(S)带毒量均较高,且小果型番茄田间发病率明显低于大果型番茄。除了Ty-1/ty-1单基因抗性不受番茄果实大小影响外,携带其他单基因或聚合基因抗性的番茄种质均与果实大小有关。在此节点上,带毒量越高抗性越弱,带毒量越低抗性越强。总体来说,在遭受番茄黄化曲叶病毒侵染时,小果型番茄田间抗性强于大果型番茄。
关键词:番茄;果实大小;带毒量;黄化曲叶病毒;抗性
中图分类号:S641.2 文献标志码:A 文章编号:1673-2871(2024)06-037-08
Synergistic effect of fruit shape and resistance genes on the titer of virus carried by tomato yellow leaf curl virus
MI Guoquan1, TANG Yanling1, MA Kai1, ZHANG Chunqi2, CAI Yuxin3, JING Yancai1, NIU Lili1, LI Hongbo2, ZHU Yong2, CHEN Huili3, SHI Xuanjie1
(1. Vegetable Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China; 2. Luoyang Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Luoyang 471023, Henan, China; 3. Henan Qingfa Seeds Co., Ltd., Zhengzhou 450002, Henan, China)
Abstract: In this study, 12 tomato germplasm with 3 different resistance genes and two kinds of fruit sizes were selected as samples to reveal the relationship between fruit size, resistance genes and field resistance and virus concentration of tomato yellow leaf curl virus. The results showed that in the case of natural transmission, virus infection can be detected in all tomato materials. On the 28th day after tomato seedlings were planted, the viral loads of small-fruit tomatoes M8(I), M5(I), M3(I), M7(I), M9(I)and M11(HR) were low, while those of large-fruit tomatoes M6(S), M10(S), M4(S)and M2(S)were high, and the incidence of infection in small-fruit tomatoes was significantly lower than that in large-fruit tomatoes. In addition to Ty-1/ty-1 single gene resistance was not affected by tomato fruit size, tomato germplasm carrying other single gene or polymeric gene resistance was related to fruit size. At this node, the higher the amount of poison, the worse the resistance, and the lower the amount of poison, the stronger the resistance. In general, the field resistance of small fruit tomatoes was higher than that of large fruit tomatoes when infected with tomato yellow leaf curl virus.
Key words: Tomato; Fruit size; Virus concentration; Tomato yellow leaf curl virus; Resistance
番茄是世界上广泛种植的一种蔬菜作物,也是我国主栽的蔬菜作物之一。烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)病是限制番茄生产的最重要病害之一[1]。培育抗病品种是控制番茄黄化曲叶病毒病的有效方法和手段之一。迄今为止,已在野生番茄中定位到7个独立遗传的主要抗性基因,包括S. chilense(Ty-1、Ty-3、Ty-3a、Ty-4和Ty-6),S. habrochaites syn. L. hirsutum(Ty-2)和S. peruvianum(Ty-5)。Ty-1和Ty-2基因表现为完全显性或接近完全显性,而Ty-3则表现出更多的加性效应。Ty-1、Ty-2、Ty-3和Ty-3a已被广泛应用于对抗单组分和双组分双生病毒的抗性育种中,Ty-4、Ty-5和Ty-6抗性基因尚未被开发[2]。由于Ty基因一般表现为显性,单基因F1杂种抗性基因的作用不如纯合系。因此,如果要使杂种表现为抗性有效,要么双亲都具有抗性,要么双亲包含多个抗性基因[3]。
TYLCV的潜伏期较短,一般7~10 d就开始表现发病症状[4]。TYLCV感病植株主要表现为叶片卷曲、皱缩、黄化、植株矮化等[5]。该病自20世纪90年代传入中国[6],呈现逐年加重、自南向北蔓延的趋势,加强番茄黄化曲叶病毒病的病原鉴定和检测,制定防治策略和培育抗病毒品种成为当前十分重要的任务[7]。目前,关于番茄种质资源的抗性研究较多的是抗性基因[1,8]。笔者在生产实践中发现,在自然感病情况下,小果型番茄整体对TYLCV抗性明显高于大果型番茄,甚至出现免疫级别的种质,而大果型番茄尤其是粉果番茄,能够对TYLCV有免疫能力的极少,为了探明其中的原因,以小果型和大果型番茄为试验材料,通过田间抗病性表现和带毒量检测来探究番茄果型、抗性基因以及带毒量对番茄生产实践的影响。
前人的研究方法以饲养烟粉虱离体接种[9]、带有TYLCV的菌液韧皮部接种[10-11]为主。笔者利用田间带毒烟粉虱对番茄种质进行自然侵染感病,明确番茄果实大小与抗病性之间的关系,以期指导抗性种质资源的筛选、评价以及抗TYLCV番茄品种的选育。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的番茄种质12份,包含8份小果型番茄(M1、M3、M5、M7、M8、M9、M11、M12)和4份大果型番茄(M2、M4、M6、M10),详见表1。
1.2 试验设计
试验于2021年在河南现代农业研究开发基地日光温室内进行。利用秋延茬口提前45 d在大棚中种植辣椒[12]用以自然传毒和饲养烟粉虱,辣椒中间留出空地用于定植番茄。2021年6月中旬采用50孔育苗穴盘进行基质育苗,每个番茄种质播种一个穴盘,将播种后的穴盘放置于设有防虫网的隔离连栋温室中,常规育苗。待番茄苗长到5~6叶期时,定植于辣椒中间空地。试验共设3个重复,每个重复每个番茄品种定植1行,随机区组排列,每行定植12株。大棚内以烟粉虱自由繁殖方式传毒,试验期间不喷施杀虫剂,常规水肥管理。
1.3 测试项目与方法
1.3.1 田间抗病性调查与鉴定 番茄定植后,每天定时观察植株发病情况。调查定植后16、22、28和34 d田间发病情况。结合申书兴[13]、田兆丰等[14]的方法将病情分为6个级别。0 级:不发病,无症状;1级:新叶叶片轻黄化;3级:1/2叶片黄化、边缘上卷;5级:2/3叶片重黄化、矮小、少数叶片畸形;7级:叶片全部黄化、植株明显矮化;9级:叶片严重畸形缩小,植株严重矮化,甚至枯死。
病情指数=[∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高病级数)]×100。
根据通用的番茄病毒病群体分级标准,将各种质的番茄植株分为免疫(I,不表现症状,病情指数0)、高抗(HR,0<病情指数≤2)、抗病(R,2<病情指数≤15)、中抗(MR,15<病情指数≤30)、感病(S,30<病情指数≤100);并将I、HR、R 及MR 归为抗病,将S 归为感病。
1.3.2 番茄叶片带毒量测定 在定植后的0 d及16、22、28和34 d进行取样,采集每个番茄种质顶端新鲜叶片,混合取样,3次重复。液氮速冻,-80 ℃冰箱保存备用。采用CTAB法提取番茄的总DNA[15]。根据NCBI数据库中TYLCV(GenBank: AM282874.1)的基因组信息,设计引物,TYLCV2-F:GAAACGACCAGTCTGAGGCTGTAATGTC,TYLCV2-R:AAGAAACCAATAAGGCGTAAGCGTGTAG,扩增长度为322 bp。构建TYLCV标准质粒:将PCR扩增的特异条带回收、克隆,将该DNA片段克隆到pMD19-T载体上,提取质粒,并通过测序验证目的片段的正确性,测定浓度后进行拷贝数换算,将其作为TYLCV检测的阳性标准品。荧光定量PCR反应体系:qPCR 预混液 Mix 5 μL,正反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,模板1 μL,RNase Free ddH2O补足至10 μL。荧光定量PCR反应程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,56 ℃退火30,72 ℃延伸1 min,40个循环。待检测的DNA样品的质量浓度,利用超微量分光光度计调整为100 ng·μL。
1.4 数据处理
试验数据采用Excel 2010进行统计整理,计算平均值和标准差;利用SPSS 17.0进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同番茄种质田间抗病性调查与鉴定
定植后16 d和22 d调查结果如表2显示,有5个番茄种质表现出发病症状,其中包括小果型番茄M1和大果型番茄M2、M4、M6和M10,这5个番茄种质在28 d发病率均达到100%,病情指数分别为38.9、30.4、33.9、31.8和35.7,均达到感病级别;小果型番茄M3、M5、M7、M8和M9在整个试验过程中,均未表现出发病症状,抗性级别为免疫;小果型番茄M11和M12在28 d的发病率分别为5.6%和6.8%,病情指数分别为1.8和5.6,在整个试验过程中,抗性级别分别为高抗和抗病。
2.2 烟粉虱侵染对不同番茄种质绝对带毒量的影响
对于均具有Ty-1/ty-1抗性基因的M1和M2(表1),叶片中绝对带毒量差异明显(图1),小果型番茄M1带毒量峰值出现在定植后的28 d,而大果型番茄M2带毒量峰值出现在定植后的22 d,但M1在定植后16 d的带毒量已接近M2峰值,M1带毒量最大值超出M2带毒量最大值3.23倍,在田间抗性鉴定方面,M1和M2都表现为感病,但M2病情指数比M1低,这与2个种质带毒量表现一致,即带毒量越大,田间抗病表现越差,病情指数越高。表明Ty-1/ty-1抗性基因的田间抗病性表现并不受果型的影响,而与带毒量有一定关系。