甘肃省白银市黄瓜细菌性流胶病病原菌的鉴定

摘    要：黄瓜具有重要的经济价值，为明确引起甘肃省黄瓜细菌性流胶病病原菌的种类，对采集自甘肃省白银市具有典型流胶症状的样本利用组织分离法进行病原物的分离，并通过柯赫氏法则验证其致病性，再利用形态特征和分子生物学方法进行鉴定。结果表明，从发病的黄瓜茎秆中共得到4株分离物，分别命名为hxb 1，hxb 2，hxb 3和hxb 4。经柯赫氏法则验证，hxb 1是引起黄瓜流胶病的病原菌，在NA培养基上菌落呈乳白色或半透明状，圆形或近圆形，边缘光滑，菌体大小为（0.253～0.511）μm×（0.783～2.290）μm，为短直杆状，革兰氏染色阴性。再利用16S rRNA和gyrB进行基因序列分析，发现hxb 1均与荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）聚在一支，同源性均为100%，结合形态学特征将菌株hxb 1鉴定为荧光假单胞菌。研究结果为黄瓜细菌性流胶病的诊断和综合防治提供了理论依据。

关键词：黄瓜细菌性流胶病；病原菌；分离鉴定；荧光假单胞菌

中图分类号：S642.2                          文献标志码：A                    文章编号：1673-2871（2024）07-036-06

Identification of cucumber bacterial gummosis pathogens in Baiyin city， Gansu province

CHEN Fei1， WANG Yidan2， MA Ting2， CAI Fengfeng2， JIN Mengjun2， ZHANG Cuiwen2， YANG Chengde2

（1. Seed Management Station of Xigu District， Lanzhou City， Lanzhou 730060， Gansu， China; 2. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University/Bio-control Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province， Lanzhou 730070， Gansu， China）

Abstract： In order to clarify the pathogen of cucumber bacterial gummosis in Gansu province， the samples collected from Baiyin city with typical gummosis symptoms were isolated by tissue separation method， and the pathogenicity was verified by Koch 's postulate. Then morphological characteristics and molecular biology methods were used for identification. The results showed that four isolates were obtained from the diseased cucumber stems， named hxb 1， hxb 2， hxb 3 and hxb 4， respectively. It was verified by Koch 's postulate that hxb 1 was the pathogen causing cucumber gummosis， and its colonies on NA medium were milky white or translucent， round or nearly round， with smooth edges. The cell size was（0.253-0.511）μm×（0.783-2.290）μm， which was short straight rod and gram-negative. Using 16S rRNA and gyrB genes sequence analysis， it was found that hxb 1 was clustered with Pseudomonas fluorescens， and the homology was 100%. Combined with morphological characteristics， the strain hxb1 was identified as Pseudomonas fluorescens. The research results provide a theoretical basis for the diagnosis and comprehensive prevention of cucumber bacterial gummosis.

Key words： Cucumber bacterial gummosis; Pathogenic bacteria; Identification; Pseudomonas fluorescens

黄瓜（Cucumis sativus）是葫芦科黄瓜属一年生草本植物，富含蛋白质、胡萝卜素、维生素、葡萄糖等营养成分，具有抗衰老、利水消肿和清热止咳的作用[1]，是我国主要的经济作物之一，在全国各地均有栽培。随着我国农业产业结构调整以及现代农业科技的迅速发展，冬季设施黄瓜生产面积逐年增加，以塑料大棚和日光温室为主的设施栽培已逐步成为黄瓜的主要生产方式。然而，随着黄瓜产业的发展，连作现象普遍发生，导致大棚土壤酸化严重和微生物结构被破坏[2]，且设施生产中的高温、高湿特点为病原菌的侵染和传播提供了适宜的条件，病虫害的发生频率有所升高[3]。

黄瓜细菌性流胶病是近年来在黄瓜上比较常见且危害较重的病害，主要症状为在发病果实表面、茎秆、叶片背面产生流胶现象，严重时茎秆纵向开裂并腐烂，导致植株死亡，因此又被称为“黄瓜细菌性茎软腐病”。该病在黄瓜的整个生育期及各个器官均可发生，发病初期茎秆呈水渍状，湿度大时会溢出大量白色菌脓，随着病情发展，茎秆纵向开裂、软腐，严重时整株死亡；发病果实表面看起来正常，但内部已开裂、腐烂或者褐变；叶片从边缘或者中心发病，出现不规则水渍状淡黄色病斑，最后会导致叶片腐烂[4]。该病害近几年在全国各地大面积暴发，尤其在冬季黄瓜设施栽培中极易发生和流行，病害严重的棚室会导致30%以上的减产，甚至绝收，对黄瓜产业的发展产生了巨大影响[5]。据报道引起黄瓜细菌性流胶病的病原菌有胡萝卜软腐果胶杆菌巴西变种（Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense，简称Pcb）[6]、丁香假单胞流泪致病变种（Pseudomonas syringae pv. lachrymans，简称Psl）[7]和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens，简称P. fluorescens）[8]，也有研究认为Pcb和Psl共同侵染导致流胶病发生[9]。目前甘肃省白银市黄瓜流胶病的病原菌未见报道。因此，笔者从白银市大棚中采集典型症状标本，并带回室内进行病原菌分离、致病性测定及鉴定，以期为黄瓜流胶病的诊断和综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试样本

于2020年12月在甘肃省白银市靖远县东湾镇种植大棚内采集到具有典型细菌性病害症状的黄瓜样本，拍照并带回实验室进行鉴定。

1.2 供试培养基

NA培养基：琼脂18 g，蛋白胨6 g，牛肉膏3 g，葡萄糖8 g，蒸馏水定容至1000 mL；NA液体培养基：蛋白胨6 g，牛肉膏3 g，葡萄糖8 g，蒸馏水定容至1000 mL；KB培养基：蛋白胨20 g，甘油10 mL，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸馏水定容至1000 mL。

1.3 病原分离

通过组织分离法从发病黄瓜茎秆中分离病原物[10]。用无菌水清洗黄瓜病茎，用灭菌的剪刀将病健交界处剪成5 mm×5 mm大小的组织，使用75%乙醇浸泡30 s进行消毒。将消毒后的样品用无菌水冲洗3次。吸干表面水分后置于灭菌研钵中，加入1 mL无菌水后进行研磨。将研磨后的组织液静置5 min，吸取上清液1 mL于NA固体培养基上，用灭菌涂布器涂抹均匀。将接种后的平板于28 ℃培养箱中黑暗条件下培养48 h，待其长出单菌落后，用平板划线法纯化出大小、形态和颜色一致的单菌落转接到试管中并编号，储存在4 ℃的冰箱中备用[11]。

1.4 致病性测定

以黄瓜品种津研1号为试验材料，进行致病性测定，种子购买于当地种子市场。当黄瓜幼苗长至30 d左右时，将分离物转移到NA培养基上活化，于28 ℃黑暗培养48 h，用接菌环挑取10个单菌落至100 mL NA液体培养基中，在28 ℃、180 r·min-1摇床中振荡培养24 h左右，直至OD值约为0.8。

用75%的乙醇擦拭用于接种病原的黄瓜茎秆，然后用灭菌的昆虫针轻轻针刺，用无菌棉花蘸取适量菌液均匀涂抹在刺伤的茎秆上，每个处理6次重复。将接种后的黄瓜幼苗在室温下保湿培养24～36 h后，连续观察和记录茎秆上的病害发生情况，用接种NA培养基的健康植株作为对照。

1.5 形态学鉴定

将病原菌接种到NA培养基上，28 ℃黑暗培养24 h，观察菌落形态，记录并拍照。然后对菌落进行革兰氏染色，用100×光学显微镜观察病原菌的形态，并随机选取100个菌体测量大小[12]。

1.6 荧光反应测定

将病原菌接种于KB培养基黑暗培养48 h后，在紫外灯下观察菌落在KB培养基上荧光的发生情况。

1.7 分子生物学鉴定

用接菌环挑取10个单菌落于100 mL NA液体培养基中，在28 ℃、180 r·min-1摇床中振荡培养24～36 h，至OD值为0.6～0.8，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取病原菌的DNA。使用通用引物 16S rRNA（27F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）[13]和特异性引物gyrB（UP-1： 5'-TGCGGTCAACCAGGTGTTCC-3'/UP-2r： 5'-CGAGATAATCGCGGTCAGG-3'）[14]进行PCR扩增（引物合成由西安擎科生物有限公司完成）。

16S rRNA的反应体系为25 μL： 12.5 μL Mix（2×），1 μL模板DNA，27F和1492R（10 μmol·L-1）各1 μL， 9.5 μL ddH2O。gyrB的反应体系为25 μL：12.5 μL Mix（2×）， 1 μL模板DNA，UP-1和UP-2r（10 μmol·L-1）各1 μL，9.5 μL ddH2O。

16S rRNA的扩增程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；48 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；40个循环；72 ℃ 1 min；4 ℃保存。gyrB的扩增程序为：94 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35个循环；72 ℃ 2 min；4 ℃保存。

用0.1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，将带有明显条带的PCR产物送至兰州天启基因生物技术有限公司进行测序。再利用BLAST将测得的序列与GenBank数据库中已有的序列进行同源性比对，然后用MEGA7.0采用邻接法构建系统发育树（bookstrap值为1000），进一步明确病原菌的分类地位。