山药块茎膨大期DoCDPK1基因生物信息学及低温胁迫下的表达分析

摘    要： 钙依赖性蛋白激酶（CDPK）在植物的生长发育及逆境胁迫方面发挥着重要作用。以大和长芋和毕克齐山药为试验材料，克隆钙依赖性蛋白激酶基因DoCDPK1，并对其进行生物信息学分析，为DoCDPK1基因的功能研究奠定基础。采用生物信息学方法分析DoCDPK1基因结构，构建瞬时表达载体，对DoCDPK1蛋白进行亚细胞定位；采用qRT-PCR分析DoCDPK1基因在不同山药品种的不同发育阶段及低温胁迫处理下的表达模式。结果表明：（1）DoCDPK1基因序列长度为2023 bp，编码521个氨基酸。（2）DoCDPK1与几内亚薯蓣CDPK蛋白序列的一致性为97%，且DoCDPK1存在STKc_CAMK结构域。（3）瞬时表达分析表明，DoCDPK1蛋白定位于细胞核与细胞膜。（4）大和长芋山药中的CDPK活性更高，DoCDPK1可能参与调控山药块茎膨大后期的生长发育。（5）经4 ℃低温胁迫后，CDPK活性降低，DoCDPK1表达量上调，且表达水平在不同时间处理下存在差异。综上所述，DoCDPK1可能参与调控山药块茎膨大后期的生长发育及低温胁迫响应过程。

关键词： 山药；钙依赖性蛋白激酶；亚细胞定位；低温胁迫；基因表达量

中图分类号：S632.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）07-042-10

Bioinformatics and expression analysis of DoCDPK1 gene under low temperature stress during tuber expansion stage of yam

GAO Jingjing1， ZHANG Yanfang1， XING Li’nan1， GE Mingran1， JI Xiang2， HUO Xiuwen1

（1. College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010019， Inner Mongolia， China; 2. Inner Mongolia Agricultural and Animal Husbandry Technology Extension Center， Hohhot 010011， Inner Mongolia， China）

Abstract： Calcium-dependent protein kinase plays an important role in plant growth and osmotic stress. Using Dahechangyu and Bikeqi yam as experimental materials， the calcium dependent protein kinase gene DoCDPK1 was cloned and bioinformatic analysis was performed to lay a foundation for the functional study of DoCDPK1. The structure of DoCDPK1 was analyzed by bioinformatics and subcellular localization of DoCDPK1 protein was performed by constructing transient expression vector. qRT-PCR was used to analyze the expression patterns of DoCDPK1 at different developmental stages and under low temperature stress in different yam varieties. The results indicated：（1）The length of DoCDPK1 gene sequence was 2023 bp， encoding 521 amino acids.（2）The consistency of the protein sequence between DoCDPK1 and CDPK protein sequence of Dioscorea cayenensis subsp. was 97%， and DoCDPK1 had STKc_CAMK domain.（3）Transient expression analysis showed that DoCDPK1 protein was localized in cell nucleus and membrane.（4）The CDPK activity in Dahechangyu was higher， and DoCDPK1 might be involved in regulating the growth and development of yam tuber at the later stage of enlargement.（5）After low temperature stress at 4 ℃， CDPK activity decreased， and the expression of DoCDPK1 was up-regulated， with differences in expression levels observed under different time treatments. In conclusion， DoCDPK1 gene may be involved in regulating the growth and development of yam tuber and its response to low temperature stress.

Key words： Yam; Calcium-dependent protein kinase; Subcellular localization; Low temperature stress; Gene expression

山药（Dioscorea opposita Thunb.）为薯蓣科薯蓣属多年生缠绕草本单子叶植物[1]。山药块茎中含有大量的淀粉、蛋白质和氨基酸等营养物质，是日常生活的滋补佳品[2-3]。中国是山药重要的原产地和驯化中心[4]，随着“南薯北移”和“北种西扩”策略的实施，内蒙古西部地区以其独特的气候环境和地理条件，山药的种植面积逐年扩大。但由于气温较低，山药的有效发育周期不足180 d，中晚熟品种不能完全成熟，因此山药产量和品质偏低。如果能增强山药的耐寒能力，延长生育期，从而提高山药的产量和品质，就能实现经济效益的最大化。因此，如何提高山药的耐寒性是内蒙古西部地区种植山药亟待解决的问题和当下研究的热点[5-7]，其中对抗逆基因的挖掘是培育高抗逆性山药品种的重要工作。

植物发育过程中会受到逆境胁迫，使其正常生长受到影响，甚至死亡。植物在适应环境的过程中，逐渐形成了各种调控机制来应对不利环境，而钙信号传导系统就是其中之一[8-9]。Ca2＋作为重要的第二信使，经Ca2＋受体蛋白、钙调素（calmodulin，CaM）和钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDPK）等的协同作用，感知Ca2＋浓度的变化并识别钙信号，将钙信号向下游传递并级联放大，从而促进产生响应蛋白，进一步调控植物的生长发育以及免疫应答和胁迫响应，以应对环境胁迫损伤，提高自身抗性[10-12]。CDPK在植物细胞中是主要的Ca2+传感器，是一类依赖Ca2+的Ser/Thr型蛋白激酶，在植物的生长发育过程及应对非生物胁迫反应中发挥重要作用[13-14]。CDPK基因在植物种子、果实、茎、叶以及根中均有高度表达[15-16]。目前，有些植物CDPK基因的家族成员已经被鉴定，拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有34个[17]，玉米（Zea mays）中有40个[18]，水稻（Oryza sativa）中有31个[19-20]，此外，铁皮石斛（Dendrobium officinale）[21]、广东桑（Morus atropurpurea）[22]、番茄（Solanum lycopersicum）[23]和山药[24]等多种植物中的CDPK基因也被陆续分离和鉴定[25-27]。通过深入研究发现，CDPK基因具有能够响应逆境胁迫的生物学功能，秋石斛的DenCDPKs基因受低温诱导表达，参与低温胁迫响应过程[28]；玉米的ZmCDPK6基因可以响应高温胁迫，同时还受到盐和低温胁迫的诱导表达[29]。

鉴于CDPK基因在响应低温逆境胁迫过程中的重要性，推测山药中的CDPK基因也有可能存在该生物学功能。因此，笔者通过测定山药块茎的CDPK活性，基于转录组测序和RT-PCR技术，克隆DoCDPK1基因、进行生物信息学分析及亚细胞定位，比较不同发育时期毕克齐与大和长芋山药块茎中该基因的表达情况，同时对低温胁迫下大和长芋组培苗中DoCDPK1基因的表达情况进行比较，为进一步研究DoCDPK1基因在山药生长发育过程中的功能及参与低温胁迫响应过程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以内蒙古农业大学蔬菜种质资源课题组种植、保存的毕克齐山药（B1）与大和长芋山药（DHCY）种质资源为试验材料。B1为内蒙古主栽品种，为细长形山药；DHCY为高产山药品种，山药茎为圆形（图1）。2023年5—10月在内蒙古农业大学种质资源圃，选取10～15 cm晾晒好的山药栽子播种，采用搭架栽培、双行种植的模式，行距70 cm，株距20 cm，于5月8日人工种植，常规田间管理。选择种植后90、105、120、135、150和165 d长势一致的山药，每个时期随机挖取3株，进行地下块茎采样，洗净后称取2 g，3株等量混样；选取在MS固体培养基中生长4周的DHCY山药组培苗叶片，称取1 g，3株等量混样；各样本均设3次生物学重复，经液氮速冻，置于-80 ℃冰箱保存，以备后续试验。

1.2 钙依赖性蛋白激酶活性测定

称取山药块茎0.2 g，组培苗叶片0.1 g，在预冷过的pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中漂洗，滤纸拭干，放入5 mL的匀浆管中。按质量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加入9倍体积的PBS于匀浆管中，冰水浴条件下，剪碎组织块。用高通量组织研磨机（SCIENTZ-192）在冰水中制备匀浆液，将制备好的匀浆液用低温低速离心机（Allegra X-30R Centrifuge），在4 ℃、3000 r·min-1下离心15 min，取上清液。参考植物钙依赖性蛋白激酶（CDPK）测定试剂盒说明书进行测定，试剂盒购自上海优选生物科技公司。对B1与DHCY 6个取样时期的山药块茎及DHCY山药组培苗叶片的钙依赖性蛋白激酶活性进行测定，3次生物学重复，取平均值。

1.3 基于山药转录组数据分析DoCDPK1基因表达水平

基于课题组的山药转录组测序数据（2019年诺禾致源生物信息科技有限公司测定），筛选钙依赖性蛋白激酶DoCDPK1基因（XP_010261434.1），并对B1与DHCY6个取样时期山药块茎中DoCDPK1基因的表达水平进行分析。

1.4 山药总RNA的提取及cDNA合成

参照索宁宁等[30]的试验方法，分别提取B1与DHCY山药不同发育时期块茎以及DHCY山药组培苗的总RNA。用TaKaRa公司的（PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA SynthesisKit）试剂盒反转录成单链cDNA。