葫芦科作物耐低温育种研究进展

摘 要：低温胁迫制约了葫芦科作物冬季栽培。首先综述了选择育种、引种、杂交及杂种优势利用在葫芦科作物耐低温育种中的应用，并列举了当前保存葫芦科种质的资源库，然后综述了倍性育种及嫁接导致的可遗传变异在耐低温育种中的潜在作用以及葫芦科基因组测序现状，并列举了响应低温胁迫的相关基因或位点，整理了基因编辑应用于葫芦科耐低温性研究的最新进展，最后介绍了葫芦科作物响应低温胁迫的相关表现，为耐低温性评价提供参考。

关键词：葫芦科；育种；耐低温；基因编辑

中图分类号：S642+S65 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）08-001-07

Research progress on low temperature tolerance breeding of Cucurbitaceae crops

WU Zhengjing1， ZHANG Hao1， LIU Sujuan1， AN Bingjie1， WU Jingjing1， LONG Yuan1， SONG Chunlei2

（1. College of Horticulture and Plant Protection， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， Henan， China; 2. Agricultural and Rural Bureau， Xin'an County， Xin’an 471899， Henan， China）

Abstract： Low temperature stress restricts winter cultivation of Cucurbitaceae crops. This review first summarizes the application of selective breeding， introduction， hybridization and heterosis utilization in low temperature tolerance breeding of Cucurbitaceae， and lists the current resource libraries for Cucurbitaceae germplasm preserving. Subsequently， the potential roles of heritable variations caused by ploidy breeding and grafting in low temperature tolerance breeding and the current status of genome sequencing in the Cucurbitaceae family were reviewed. Relevant genes or loci responding to low temperature stress were listed， and the latest progresses in gene editing applications for low temperature tolerance research in the Cucurbitaceae family were summarized. Finally， the relevant performances of Cucurbitaceae crops in response to low temperature stress were introduced， which provided reference for the evaluation of low temperature tolerance.

Key words： Cucurbitaceae; Breeding; Low temperature resistance; Gene editing

目前，葫芦科作物至少有965种，并分为95属，主要分布在热带和亚热带地区，对低温胁迫的耐受性普遍较低。全球范围内栽培的葫芦科作物主要有西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜等，此外，丝瓜、苦瓜、冬瓜和葫芦（瓠瓜）在亚洲也较常见，葫芦是葫芦科砧木的重要材料。据联合国粮农组织统计，2022年全球主要葫芦科作物产值高达1480亿美元，其中仅亚洲地区就占比82.5%[1]。低温胁迫会导致植物出现多种生理异常，统称为低温损伤（chilling injury，CI），低温损伤最具代表性的特征是细胞膜结构受损[2]，植株生长发育出现异常。

遗传育种工作者利用传统育种手段评价了大量葫芦科种质资源，对其耐低温性的遗传规律进行研究[3-5]，培育出一系列耐低温新品种，为葫芦科耐低温资源的评价和利用奠定了基础。近年来，通过基因组测序和基因功能分析，深入研究了在葫芦科作物生长发育过程中起关键作用的基因和位点；CRISPR/Cas9基因组编辑系统允许靶向修饰特定基因，对参与低温响应的相关基因与位点有了更清晰的理解，有助于培育对低温具有更强耐受性的葫芦科新品种。

1 传统育种手段

1.1 选择育种与引种

葫芦科耐低温选择育种已开展多年，但天然耐低温种质的缺乏导致有关耐低温选择育种的报道较少；引种是筛选出能够适宜当地栽培环境且具有较强低温耐受性品种的常用手段，例如潍坊地区引入节瓜碧绿翡翠[6]，上海地区引入苦瓜绿箭霸王[7]。

1.2 杂交育种及杂种优势利用

育种工作者常通过杂交以及对杂交后代的筛选、纯化，获得具有优良亲本性状的新品种[8-9]。杂种优势利用是葫芦科育种最常用的手段，其亲本组配特别强调杂种一代的优势表现，近几年利用杂种优势培育出的耐低温葫芦科新品种有甜瓜金蜜一号[10]、西葫芦京葫36[11]、南瓜国品天香[12]和节瓜花玉女[13]等。雌性系常作为杂种优势利用的母本材料，能够降低育种成本，研究人员已经利用全雌性母本培育出一系列葫芦科耐低温新品种，例如黄瓜欣剑[14]和苦瓜秀玉1号[15]等。

目前保存有葫芦科种质资源的主要数据库、机构和项目如表1所示。

1.3 诱变育种

诱变育种具有耗时短、成本低、操作简单、变异频率高和范围广等特点。化学诱变无需物理诱变所用的昂贵设备，且产生点突变的频率更高，常用于葫芦科的抗逆性育种。常用的化学诱变剂有甲基磺酸乙酯（EMS）和叠氮化钠（NaN3）等，Khan等[16]认为，NaN3诱导叶绿素和植物形态突变的频率高于EMS。葫芦科作物通常选择子叶或种子作为诱变材料，因为其细胞分裂旺盛，易发生突变。确定诱变剂最佳剂量的原则是以更少的损失获得更多的突变型，半致死剂量（LD50）通常被认为是诱变的最佳浓度[17]。杨国志[18]利用0.5～2.0 mmol·L-1 NaN3处理西瓜种子，然后选择再生率接近50%的处理时间和浓度（1.5 h，1.5 mmol·L-1）为最佳诱变方案，最终诱变并筛选出在低温胁迫下表现良好的西瓜植株。多种技术组合可以提高育种效率，例如组织培养用于缩短时间，诱变用于拓宽变异，标记检测用于鉴定变异[19]；对同一材料施加多种诱变剂也能有效拓宽突变谱。

1.4 倍性育种

葫芦科单倍体育种一般通过花药离体培养、辐射花粉和离体胚挽救获得单倍体植株[20]，然后通过秋水仙素处理使其恢复正常染色体数，相对于杂交育种，可缩短育种年限，例如通过单倍体技术快速纯化获得的黄瓜耐低温系H064-1-2[21]。多倍体育种通过人工诱变或基因组学等手段使染色体组加倍，常应用于三倍体无籽西瓜育种。杨炳艳等[22]发现西瓜83166同源三倍体的耐冷性强于二倍体；刘文革等[23-24]研究不同倍性的西瓜发现，多倍体西瓜的耐冷能力高于二倍体西瓜。

1.5 嫁接

Janos Taller等[25-26]通过开展辣椒种内嫁接并繁殖接穗后代，再加以选择，培育出一系列综合性状优良且稳定的辣椒新品种。嫁接技术广泛应用于葫芦科作物栽培，耐低温南瓜砧木增强了西瓜[27]和南瓜[28]接穗的低温耐受性。葫芦科耐低温砧木与低温敏感接穗间存在miRNAs[29]和移动mRNA[30]的交流与表达变化，且异源嫁接组合比同源嫁接组合的交流更频繁，低温耐受性也更强。南瓜和黄瓜的嫁接试验结果表明，嫁接黄瓜自交后代发生可遗传的变异[31]。

2 分子育种

全基因组测序和相关基因功能的研究为分子育种开辟了道路，使基因编辑成为葫芦科耐低温育种的新途径。

2.1 葫芦科作物基因组测序

2009年，首个葫芦科作物黄瓜的基因组测序完成[32]，第二个是甜瓜[33]，第三个是西瓜[34]。截至目前，世界各地的研究人员先后完成了葫芦科中至少87个品种的基因组测序[35]，有苦瓜[36]、丝瓜[37]、南瓜[38]、波棱瓜[39]、刺角瓜[40]和冬瓜[41]等。复杂的基因组序列及注释可以使人们对基因功能的认识更加清晰。

2.2 葫芦科作物参与低温响应的相关基因或位点

QTL定位已应用于识别葫芦科作物中不同性状的相关位点[42-44]。表2列出了葫芦科作物参与低温响应的相关基因。

Chung等[45]认为黄瓜幼苗的耐低温性是由多个位点的等位基因控制的，其中一部分遗传自母本Chipper的叶绿体基因组；同样，耐低温黄瓜NC76和Chipper与低温敏感品种经低温处理后在叶绿体相关基因CSatpB和CSycf1上存在差异[46]。Dong等[47]发现，生长素反应因子Csa6G445210和乙烯反应跨膜蛋白基因Csa6G445230可能是黄瓜幼苗耐低温性的候选基因。黄瓜叶片中有37个CsaGRAS对短期或长期低温胁迫有响应，存在相互作用，并可能是CBF耐低温途径的下游因子[48]。Zhao等[49]报道了褪黑素通过上调CsZat12转录水平来缓解黄瓜幼苗遭受的低温损伤。赵振翔等[50]认为，CsDMEs参与了黄瓜的低温响应。袁晓等[51]发现低温处理诱导了黄瓜幼苗和叶片中GolS2的表达。

水杨酸与CBFs（特别是CBF3和CBF4）在西瓜耐低温响应过程中具有协同作用[52]，同样，南瓜CmoCBF1和CmoCBF3的mRNA丰度在低温胁迫下被高度诱导[28]。Yan[19]等在西瓜基因组中鉴定出40个ClHDZs，一半的ClHDZs在低温下表现为转录水平上调（ClHDZ18、ClHDZ30、ClHDZ35等），少数表现为下调（ClDHZ3、ClHDZ23）。AtPDLP5控制拟南芥细胞间通信和防御信号，而西瓜的同源基因Cla003949在低温下表达上调[53]。

南瓜中大多数CmoGS在低温下RNA丰度会发生变化，但变化趋势略有不同，与短期低温胁迫相比，长期低温胁迫下的变化更为显著[54]。低温胁迫下南瓜砧木上调了西瓜接穗中多胺代谢通路关键基因ADC的表达，提高了嫁接植株的低温耐受性[27]。南瓜应激响应基因CmNAC1是ABA信号通路的关键因子，在适应低温中发挥正向作用[55]。将南瓜耐低温株系和低温敏感株系对比发现，CmRCC1[56]和CmoDof4.6[57]对低温有响应表达。

低温弱光下丝瓜G6PDH、PER5和ATPβ的表达量呈先上升后下降的趋势[58]，与其类似的还有LcUBQ[59]。CmNCED3通过提高脱落酸水平来增强甜瓜幼苗的耐低温性[60]。甜瓜在低温处理后有11个CmWRKYs表达量显著上调[61]。CmAHP1～CmAHP5均参与了甜瓜低温响应，其中CmAHP4可能是关键的候选基因[62]。杜文丽等[63]从苦瓜中筛选出WRKY23、MYB108和ERF017等低温响应候选基因。赵添悦等[64]发现，冬瓜中BhWRKY2、BhWRKY5和BhWRKY39参与了低温响应。

2.3 通过基因编辑增强葫芦科作物耐低温性