番茄SlDOGL4转录因子基因的克隆和表达分析

摘 要：为了明确SlDOGL4基因在番茄中的耐盐作用，以栽培番茄Ailsa Craig为试验材料，克隆该基因并通过生物信息学方法分析其理化性质和表达特性。结果表明，SlDOGL4基因CDS全长660 bp，编码219个氨基酸；保守结构域分析结果表明，该基因仅含有1个DOG1结构域，属于bzip转录因子中的DOG1家族成员；系统进化关系表明，SlDOGL4与马铃薯的StDOGL4蛋白亲缘关系较近。组织表达谱结果表明，SlDOGL4基因主要在根和破色期果实中表达。亚细胞定位结果表明，SlDOGL4蛋白定位于细胞核。SlDOGL4基因启动子上有多种与非生物胁迫和激素响应相关的顺式元件。构建ProSlDOGL4：：GUS融合表达载体，遗传转化番茄检测启动子活性，GUS组织化学染色结果表明，SlDOGL4在根、茎、生长点、种子等组织中都有表达，表明该基因在番茄整个生长发育过程中发挥重要作用。通过公共数据库中转录组数据分析表明，SlDOGL4基因的表达受到盐、干旱、冷和热胁迫不同程度的诱导。为了进一步验证SlDOGL4基因的功能，在盐处理后，SlDOGL4基因的转录水平呈先升高后降低的趋势，且在盐处理2 h后达到最高转录水平。研究结果为探索SlDOGL4基因在番茄耐盐中的功能奠定了基础。

关键词：番茄；SlDOGL4；非生物胁迫；亚细胞定位；转录水平

中图分类号：S641.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）08-024-10

Cloning and expression analysis of tomato SlDOGL4 transcription factor gene

WANG Yiyi1，FAN Bingli1，LI Ying1，WANG Gaixue1，XUE Dongqi1，LI Yan2，GAO Yanna1

（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046， Henan， China; 2. Zhumadian Academy of Agricultural Sciences， Zhumadian 463000， Henan， China）

Abstract： In order to clarify the salt-tolerance effect of SlDOGL4 gene in tomato， the cultivated tomato Ailsa Craig was used as the experimental material to clone this gene and analyze its physicochemical properties and expression characteristics through bioinformatics methods. The results showed that the full length of CDS of SlDOGL4 gene was 660 bp， encoding 219 amino acids. Conserved domain analysis showed that the gene contained only one DOG1 domain， which belonged to the DOG1 family of bzip transcription factor. Phylogenetic relationship showed that SlDOGL4 was closely related to StDOGL4 protein in potato. The results of tissue expression profile showed that SlDOGL4 gene was mainly expressed in root and fruit at the broken color stage. Subcellular localization results showed that SlDOGL4 protein was located in the nucleus. SlDOGL4 gene promoter has a variety of cis-elements related to abiotic stress and hormone response. The ProSlDOGL4：：GUS fusion expression vector was constructed to genetically transform tomato to detect promoter activity. GUS histochemical staining showed that SlDOGL4 was expressed in roots， stems， growing points and seeds， indicating that SlDOGL4 played an important role in the whole growth and development process of tomato. Analysis of transcriptome data from public databases showed that the expression of SlDOGL4 gene was induced by salt， drought， cold and heat stress to varying degrees. In order to further verify the function of SlDOGL4 gene， the transcription level of SlDOGL4 gene showed a trend of first increasing and then decreasing， and reached the highest transcription level after 2 hours of salt treatment. These results laid a foundation for exploring the function of SlDOGL4 gene in tomato salt tolerance.

Key words： Tomato; SlDOGL4; Abiotic stress; Subcellular localization; Transcription level

番茄（Solanum lycopersicum）起源于南美洲，在世界上普遍栽培，是最重要的蔬菜作物之一[1]。在番茄种植过程中，经常会受到各种胁迫的影响，造成番茄品质和产量下降，严重时会导致整株死亡，带来巨大的经济损失。野生番茄能够在较高盐胁迫环境下完成生长周期，但是在长期的人工种植过程中，人们更注重果实产量，而非耐盐性状，从而导致番茄栽培品种对盐胁迫的耐受性降低[2]。鉴定耐盐基因和信号通路，解析生化功能和调控机制，对培育番茄新品种、保障番茄稳产和增产具有重要意义和应用价值，还能为更好地开发利用盐碱地提供物质保障。

土壤盐渍化是指高浓度Na+、Cl-、SO42-、HCO3-等可溶性盐分在土壤中积累，使土壤性质恶化和生产质量下降的过程[3]。据联合国教科文组织和世界粮农组织统计，截至2015年，全球有超过1 × 109 hm2的盐渍化土地，约占世界总耕地面积的24%；中国盐碱地总面积约9.913 × 104 hm2，世界排名第三[4]。这些盐碱地尚未有效利用，是农业发展的巨大潜力资源。除了天然盐碱土，我国还有3.6 × 107 hm2的次生盐渍化土地，严重影响作物生长和产量[5]。次生盐渍化土地主要是在农业生产过程中，不合理地施用化肥和不正确的灌溉方式导致的[6]。因此通过提高作物的耐盐性来保证现代农业的高产、高效生产，可以解决人口增加带来的粮食匮乏问题。植物的耐盐性是一个复杂的由多基因控制的数量性状，目前研究者已经发现了多个在盐胁迫信号转导中起作用的关键基因及调控通路，利用现代分子育种手段培育耐盐作物品种是未来育种工作的重点[7]。

植物耐盐调控主要有离子平衡、渗透调节、活性氧清除和激素调节。离子平衡途径－盐胁迫会破坏植物细胞内的离子平衡，必须通过维持高的K＋/Na＋比率来调节Na＋/K＋稳态，因为过量的Na＋会导致K＋的缺乏[8]。渗透调节途径－盐胁迫会导致植物细胞渗透压发生改变，需要通过代谢增加细胞内溶质浓度来保持吸水能力，多数植物会通过积累氨基酸中水溶性最高的脯氨酸来应对盐胁迫环境[9-10]。活性氧清除途径－盐胁迫会导致植物积累过多的活性氧，进而影响细胞膜的选择性，植物会通过积累超氧化物歧化酶和过氧化物酶等保护酶来清除过多的活性氧，玉米ZmGRAS13基因通过提高过氧化物酶和过氧化氢酶活性来应对高盐胁迫[11]。激素调节途径－植物在盐胁迫条件下会诱导赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）等多种激素的表达来影响植物的生长发育和代谢过程，进而起到耐盐调控的作用。黄洁等[12]、纪超等[13]的研究表明，植物受到盐胁迫的早期，根系的ABA含量会迅速升高，在到达峰值后，趋于平稳，并且ABA可以通过调节植物气孔的作用来抵抗盐胁迫。

DOG1家族属于bZIP转录因子家族[14]。在植物中，bZIP转录因子组成了最大的ABA诱导DNA结合蛋白家族，对植物生命周期的所有阶段基本都有影响，可以调节植物生长发育进程，如种子发育、光信号传递、花发育、生物和非生物胁迫、ABA信号和激素反应[15]。研究表明，bZIP转录因子在胁迫条件下，可与ABA诱导基因的启动子区域结合，调节下游靶基因表达，在生物和非生物胁迫的抗逆反应中起重要作用[16]。

拟南芥中DOG1家族成员主要与种子休眠有关，Zhu等[17]、Sall等[18]的研究表明，AtDOGL4基因负调控种子休眠和ABA响应，并且DNA去甲基化酶基因ROS1通过正调控DOGL4基因的表达来影响这些进程。ROS1基因可以通过介导的碱基切除修复来实现甲基化和去甲基化，协同调控DNA甲基化，并直接影响逆境胁迫相关基因的表达。杜驰等[19]的研究表明，盐胁迫能够提高盐穗木中ROS1基因的表达，降低基因组DNA的甲基化程度，进而增强植物的耐盐性。

为了研究SlDOGL4基因是否可以提高番茄的耐盐性，笔者在番茄中克隆SlDOGL4基因，分析其蛋白的保守结构域、启动子顺式作用元件、系统进化关系及理化性质；利用实时荧光定量 PCR技术分析其组织表达特异性；构建GFP融合表达载体，进行蛋白亚细胞定位分析；构建ProSlDOGL4：：GUS融合表达载体，遗传转化番茄并利用GUS组织化学分析检测启动子活性，以期为后期深入研究SlDOGL4基因的功能和耐盐调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022年4—12月在河南农业大学园艺学院进行。供试材料为番茄品种Ailsa Craig（AC）以及本氏烟草（Nicotiana benthamiana），载体为pMV2-GUS和pCAMBIA1302，均由河南农业大学园艺学院茄科课题组提供。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆 以AC叶片为材料，利用全式金公司的Trizol试剂盒提取RNA，反转录获得cDNA。在SGN数据库（https：//solgenomics.net/）中下载SlDOGL4（基因ID：Solyc02g073580）的序列信息，利用Primer 5.0设计特异性引物SlDOGL4-F/R（表1），利用K5高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，获得番茄SlDOGL4基因全长。

1.2.2 生物信息学分析 利用网站ProtParam （http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）获得基因的物理性质，利用网站NCBI-CDD获得基因的保守结构域。利用Cell-PLoc 2.0 （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）预测SlDOGL4蛋白在细胞中的表达位置。在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载SlDOGL4在不同物种中的同源蛋白的氨基酸序列，先使用DNAMAN进行氨基酸多序列对比，然后使用MEGA-X软件构建系统进化树。