发根农杆菌介导的甜瓜CRISPR/Cas9系统靶位点的检测

摘    要：选取甜瓜栽培材料龙庆八号作为受体材料，构建CmCURT1A基因CRISPR/Cas9基因编辑载体，经发根农杆菌介导检测靶位点的编辑情况，为后续甜瓜遗传转化试验提供载体基础。以甜瓜CmCURT1A基因（ID：MELO3C006053.2）为靶基因构建双靶位点敲除载体，经发根农杆菌K599介导的简单遗传转化技术使甜瓜组织长出不定根，经PCR测序发现在不定根中分别存在65 bp、72 bp不同碱基片段的缺失。该方法成功进行了甜瓜CRISPR/Cas9载体靶位点敲除情况的检测，简单高效，实现了在甜瓜中基因编辑靶点的快速鉴定，为研究甜瓜基因功能和遗传改良奠定基础。

关键词：甜瓜；CRISPR/Cas9；发根农杆菌；基因敲除

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）08-015-09

Detection of target sites of CRISPR/Cas9 system in melon by Agrobacterium rhizogenes system

ZHU Lei

（Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Daqing 163711， Heilongjiang， China）

Abstract： The cultivation melon Long Qing No. 8 was used as the receptor material to construct the CRISPR/Cas9 editing vector of CmCURT1A gene. The targe site was detected through Agrobacterium rhizogenes， which provided the vector basis for subsequent genetic transformation experiment of melon. A double target knockout vector was constructed using the CmCURT1A gene（ID： MELO3C006053.2） as the target gene. Through a simple genetic transformation technique mediated by Agrobacterium rhizome K599， adventitious roots were grown. PCR sequencing revealed that different base fragments of 65 bp and 72 bp were absent in the adventitious roots. The method was simple and efficient for the detection of CRISPR/Cas9 vector target site knockout in melon， realizing rapid identification of gene editing targets， and laying a foundation for studying the gene function and genetic improvement in melon.

Key words： Melon; CRISPR/Cas9 system; Agrobacterium rhizogenes; Gene knockout

甜瓜为葫芦科甜瓜属作物，其含有丰富的可溶性固形物和维生素等营养物质，同时也是典型的喜光、耐热植物，是我国重要的水果型经济作物。叶片是甜瓜进行光合作用的主要场所，叶片中的叶绿体吸收光能转为化学能，进而积累有机物供给植物生长发育。类囊体是叶绿体细胞器中重要的片层结构，类囊体的结构、数量、大小都可能会影响叶绿体的结构，进而影响植物的光合作用[1-2]。随着甜瓜全基因组测序工程的完成，有关甜瓜叶绿体发育相关基因的研究正在稳步进行，甜瓜叶绿体基因组中约有115个基因，且有高度保守性[3]。这些基因主要分为三大类：光合作用相关基因，叶绿体转录、翻译、表达相关基因，其他蛋白质编码基因等[4]。研究发现，在盐胁迫下，CmCUTR1A基因的表达显著下调，且叶绿体超微结构显示类囊体排列不均匀、不清晰且数量减少[5]。因此，深入研究甜瓜叶绿体相关基因CmCUTR1A，为促进甜瓜有机物的生成和产量的提高奠定了研究基础。

近年来，利用基因工程和细胞工程等技术改良园艺作物品质已取得重大进展。基因编辑技术实现了精准地对靶标基因进行定向修饰，使DNA双链断裂，并利用DNA自身的修复特性对靶标基因进行敲除、替换、插入、突变等人工修饰[6]。CRISPR/Cas9系统因具有简单、高效、精准等优点成为当前广泛应用到拟南芥[7]、水稻[8]、玉米[9]、大豆[10]、棉花[11]、番茄[12]等重要作物中的基因编辑系统[13]。CRISPR/Cas9系统在寻找靶位点时，可能会受到基因组中其他高度相似序列的干扰，导致在非目标位置发生切割，即脱靶效应[14-15]。

CRISPR/Cas9基因编辑系统在研究甜瓜基因功能方面非常重要，因此高效、准确地实现靶位点的切割是进行甜瓜基因功能分析的重要基础。由于甜瓜的遗传转化周期较长、过程复杂繁琐、转化效率偏低等，利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）[16]介导的遗传转化技术促使甜瓜产生不定根进行靶位点检测是当前可以快速获得甜瓜靶位点切割情况的方式。发根农杆菌的工作原理是利用其能力诱导植物伤口形成不定根，并通过携带T-DNA的Ri质粒侵入细胞，将T-DNA插入植物基因组中[17]。发根农杆菌介导的植物遗传转化技术已经广泛应用于大豆、黄瓜、西瓜、甜瓜等植物中[18-21]。

甜瓜遗传转化过程复杂，周期较长，且CRISPR/Cas9基因编辑系统存在一定的脱靶风险。2016年，Chandrasekaran等[22]报道了利用pKSE402基因编辑载体在黄瓜中成功敲除eIF4E单个核苷酸，但转化率不足1%；Feng等[23]利用添加了GRF/GIF生长因子基因的CRISPR/Cas9载体使得西瓜材料TC的基因编辑效率达到47.02%；2022年，Xin等[24]对甜瓜基因型、侵染时间和条件等进行优化，通过观察GFP荧光信号的强弱获得最优的遗传转化体系。因此，为了快速检测靶位点的敲除情况，便于后续甜瓜遗传转化试验的顺利进行，笔者构建了甜瓜CmCUTR1A基因双靶点基因敲除载体，并利用发根农杆菌介导甜瓜外植体产生不定根，通过不定根中GFP荧光信号的强弱进行筛选并测序，为实现甜瓜基因组编辑及基因功能的验证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选取的甜瓜栽培材料龙庆八号为黑龙江省农业科学院大庆分院自主选育的薄皮甜瓜品种，其具备可溶性固形物含量高、抗逆性强等优良性状，且再生能力较强，种质资源保存在黑龙江省农业科学院大庆分院。

1.2 田间试验设计与时间安排

2023年3月，挑选甜瓜栽培材料龙庆八号饱满种子进行催芽、育苗，于黑龙江省安达市育种基地育苗温室内进行。

2023年4－5月，选取长势一致、健壮幼苗20株，定植于黑龙江省安达市育种基地，设置随机区组，株行距30 cm×50 cm，常规肥水管理，使用地膜覆盖，田间管理采用多蔓整枝，严格控制人工自交授粉，后期进行疏花疏果，每株留1～2个瓜为宜。

2023年7月，果实成熟后采收，将采收的种子涮洗、晾干后，挑选成熟、饱满的籽粒装袋，注明品种与采收日期，以备后续试验使用。

1.3 分子试验设计

1.3.1 植物材料 分子试验材料为甜瓜栽培材料龙庆八号幼嫩叶片组织总RNA和龙庆八号成熟饱满种子。

1.3.2 菌株材料 基因克隆所使用的载体为pMD-18T，CRISPR-Cas9基因编辑载体为pKSE402、PCBC-DT1T2，载体由黑龙江省八一农垦大学园艺学院提供。大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株和发根农杆菌K599菌株分别购自上海唯地生物技术有限公司。

1.3.3 试验设计 2023年5月提取幼嫩叶片总RNA，反转录为cDNA，设计特异性引物，采用TA克隆进行CmCUTR1A基因克隆并分析序列差异；2023年7－8月构建甜瓜CRISPR/Cas9敲除载体，并进行发根农杆菌介导的甜瓜遗传转化试验。

1.4 植物总RNA的提取与cDNA的反转录

取甜瓜幼嫩叶片于2 mL离心管中，在液氮中速冻、研磨，迅速加入裂解液，后续操作按照植物总RNA快速抽提试剂盒（上海生工）说明书进行，利用高速微型离心机进行低温、高速离心。

cDNA的反转录利用HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）进行，反转录后的cDNA置于-20 ℃保存，避免反复冻融。

1.5 CmCUTR1A基因的克隆及序列差异分析

参考葫芦科基因组数据库CuGenDB（Cucurbit Genomics Database）获得CmCUTR1A基因参考序列，利用Primer Premier 5.0设计基因扩增引物。上游引物clone-F：ATGGCAGCCACGGCCTCCCCT，下游引物clone-R：TTATTCGGTTCCAGCAATCTTC。

在无RNA酶的200 μL离心管中添加：稀释5倍的cDNA 2 μL、10 μmol·L-1 clone-F/R各1 μL、2 × Rapid Taq Master Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL，用瞬时离心机进行混匀。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，35个循环数；72 ℃延伸5 min。反应后用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因条带，并利用DNA纯化试剂盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit进行切胶回收。

将目的基因与pMD-18T载体按照载体说明书进行连接，然后将反应液转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。接着，在含有50 mg·L-1氨苄青霉素的LB固体平板上倒置过夜培养于37 ℃。第2天，挑取白色饱满的单菌落，利用预先设计的引物和PCR扩增程序进行PCR检测，随后将阳性菌液送至上海生工进行测序。最后，利用DNAMAN进行序列差异比对分析。

1.6 双靶位点的选择

本研究所选取的敲除基因为甜瓜类囊体结构蛋白关键基因CmCUTR1A（Gene ID：MELO3C006053.2），在使用在线靶位点设计软件CRISPR-P2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）进行靶位点设计时，需要根据 CRISPR/Cas9 系统的特点来识别目标序列中含有PAM序列的区域。通常情况下，为确保编辑效果，在选择靶位点时会考虑其GC含量不低于40%。同时，为避免试验中出现脱靶现象，会对所选的靶位点进行特异性分析。为了提高编辑效率，选择2个靶位点进行编辑。

1.7 CRISPR/Cas9敲除载体的构建

（1）本试验所用的CRISPR/Cas9载体为pKSE402载体（以pHSE401载体为骨架改造优化），以稀释100倍的pCBC-DT1T2为模板进行4引物PCR扩增，引物序列见表1。DT1-BsF/DT2-BsR引物稀释至10 μmol·L-1；DT1-F0/DT2-R0引物稀释至5 μmol·L-1。