食用菌菌种分子生物学检测研究进展

摘    要：近年来，我国食用菌产业发展迅速，食用菌菌种混乱、来源不清等问题已成为制约产业发展的重要因素。传统的食用菌菌种鉴定方法，如形态学特征观察、品种拮抗试验等，虽然在一定程度上能够满足需求，但存在鉴定周期长、准确性不高等问题。分子生物学技术的不断进步，为食用菌产业发展提供了强大的技术支撑，也提升了食用菌菌种检测、品种鉴定与种质资源保护水平。常见的食用菌菌种分子生物学检测方法有DNA分子标记、DNA序列分析与DNA条形码技术等。DNA分子标记技术包括以分子杂交为基础的DNA标记，如RFLP；以PCR为基础的各种DNA指纹技术，如RAPD；以及以测序为基础的新型分子标记，如SNP与MNP等。DNA序列分析技术主要指ITS、IGS以及基于基因组测序技术的序列分析。DNA条形码技术包括ITS条形码和蛋白编码基因条形码，如EF-1α、β-tubulin等。概述了近年来食用菌菌种分子生物学检测领域的研究进展，提出了食用菌菌种分子检测技术的发展建议，为食用菌菌种的快速准确鉴定及品种选育等提供参考。

关键词：菌种真实性检测；分子标记；品种鉴定；机器学习；CRISPR/Cas系统

中图分类号：S646 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2024）10-009-09

收稿日期：2024-07-18；修回日期：2024-08-08

作者简介：宋浩源，男，在读本科生，专业方向为食用菌学。E-mail：shy200404060035@163.com

通信作者：赵    鹏，男，副教授，主要从事食用菌分子分类研究。E-mail：zhaop529@hotmail.com

Research progress on molecular biological detection of edible mushroom strains

SONG Haoyuan， ZHAO Peng

（School of Horticulture， Ludong University， Yantai 264025， Shandong， China）

Abstract： In recent years， edible mushroom industry of China has developed rapidly. But the problems such as confusion and unclear source of edible mushroom strains have become important issues restricting the development of the industry. Classic identification methods of edible mushroom strains such as morphologic characteristic observation， analysis of variety antagonistic reaction are time-consuming and inaccurate sometimes. The continuous progress of molecular biology technology has provided strong technical support for the development of edible mushroom industry and facilitates the detection of edible mushroom strains， variety identification and genetic resource conservation. The molecular methods of edible mushroom strains are DNA marker method， DNA sequence analysis and DNA barcoding. DNA marker techniques include the methods based on molecular hybridization such as RFLP， DNA fingerprinting methods based on PCR technique such as RAPD and novel markers based on the genome sequencing such as SNP and MNP. DNA sequence analysis technique is the analysis of ITS， IGS and the analysis based on genome sequencing. DNA barcoding technique includes the ITS barcoding and house-keeping gene barcoding such as EF-1α， β-tubulin. In this paper， the research progress on the molecular biological detection of edible mushroom strains in recent years was reviewed， and prospects for future molecular detection of edible mushroom strains was addressed， which provided reference for rapid and accurate identification of mushroom strains and variety breeding.

Key words： Mushroom strains authenticity detection; Molecular marker; Variety identification; Machine learning; CRISPR/Cas system

中国食用菌产业历经40多年的迅速发展，已然跃升为全球最大的食用菌生产、消费和出口国。2022年全国食用菌总产量4 543.86万t[1]。种业是农业的“芯片”，菌种是食用菌产业的命脉和核心竞争力。随着食用菌产业的快速发展，食用菌菌种混乱、来源不清等问题已成为制约产业发展的重要因素。通过对食用菌菌种的检测可鉴定菌种真实性，同时也可筛选具有优良性状的菌种为选育新品种提供支持[2]。对食用菌育种人员来说，准确鉴定菌种，是培育新品种的基础。此外，鉴定食用菌品种，对保障品种权利具有重要意义。通过对新品种的认定，保证了新品种的质量，防止了侵权、不正当竞争，保护了新品种发明者的合法权利[3]。

传统的食用菌菌种鉴定方法，如形态学特征观察、品种拮抗试验及同工酶电泳等，虽然在一定程度上能够满足需求，但存在鉴定周期长、准确度不高等问题[4]。随着生物技术的不断发展，与食用菌有关的遗传学与分类学研究大量开展，使分子生物学手段在食用菌菌种鉴定方面的应用范围得到了进一步的扩展，为食用菌品种鉴定与种质资源保护等提供有力的技术支撑。分子鉴定技术作为一种新兴的技术手段，在食用菌菌种鉴定中发挥着越来越重要的作用。常用的分子生物学检测技术有DNA分子标记技术、DNA序列分析[5]与DNA条形码技术等。

1 DNA分子标记技术

广义的分子标记指在分子水平上可标识的基因组中任何点位上的相互差异（遗传多样性）。狭义的分子标记是指可标识的核苷酸序列多态性[6]。分子标记与遗传标记相比具有以下优点：（1）在生物体发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；（2）大多数分子标记是共显性遗传；（3）基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的[7]。基于对DNA多态性的检测手段，可将其分为三类[8]：一是以分子杂交为基础的DNA标记技术，如RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性），二是以PCR为基础的各种DNA指纹技术，如RAPD（random amplified polymorphismic DNA，随机扩增多态性）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）、SSR（simple sequence repeat，简单重复序列）、ISSR（inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间扩增多态性）等，三是以测序为基础的新型分子标记，如SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）、MNP（multiple nucleotide polymorphism，多核苷酸多态性）等。根据需要选择适合的分子标记技术，或联合不同的标记技术为食用菌产业的发展提供保障。

1.1 RFLP（限制性片段长度多态性）技术

RFLP是最早期的分子标记技术之一。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的[9]。1995年，RFLP成功应用在食用菌菌株鉴定中[10]，后来广泛应用到食用菌的遗传研究和种群结构分析中。使用3种不同的RFLP标记和3种不同的AP-PCR（arbitrarily primed PCR，随机引物PCR）引物，成功地区分了2种草菇Volvariella volvacea和V. bombycina[11]。使用限制性内切酶Hae III和Bst F51消化ITS（internal transcribed spacer，内转录间隔区片段）成功鉴定出大多数北半球的冬菇属Flammulina物种，使用另外两种酶Bgl Ⅰ和Bst UI消化金针菇F. velutipes得到了更多的限制性片段，并且这些片段与特定的地理分布相关联[12]。目前，基于指纹图谱技术发展起来的PCR-RFLP技术因具有操作简单、成本低、重复性好等优点，被广泛应用于物种鉴定[13]。通过对58个白灵侧耳Pleurotus nebrodensis菌株ITS特异性扩增和克隆测序，建立ITS-RFLP技术，成功实现了对白灵侧耳菌种的分子检测[14]。不过，由于成本较高，检测技术繁杂，RFLP标记难以用于大规模生产实践中[15]。

1.2 RAPD（随机扩增多态性）技术

RAPD标记由Williams等[16]和Welsh等[17]于1990年创立。该技术使用1～2个随机引物（一般8～10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后经凝胶电泳分离后，检测其扩增片段多态性[18]。待测菌株基因组DNA如果在特定引物结合区域发生片段插入、缺失或碱基突变，有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子质量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。RAPD技术是一种简单、快速、准确的食用菌菌种鉴定方法[19]。目前，已被广泛应用于食用菌菌种鉴定与遗传多样性研究中。利用RAPD技术和聚类分析对木耳属Auricularia不同种和种内不同菌株进行分子鉴定，结果表明，RAPD技术能够有效地用于木耳属物种或菌株的快速准确鉴定[20]。使用RAPD技术分析了野生红菇Russula sp.子实体和从中分离的3种菌株的DNA多样性，对分离得到的3个菌株进行鉴定，结果表明这3个菌株为同一个种[21]。对46个侧耳属Pleurotus菌株进行RAPD分析和酶谱分析，结合生态和形态学数据，探讨了这些菌株的遗传多样性和系统发育的关系[22]。利用RAPD分子标记技术对8个黑木耳Auricularia auricula生产菌株进行分子鉴定，通过NTSYS软件进行聚类分析，结果显示这些菌株之间的遗传相似性在0.53～0.97之间，遗传差异较大，为黑木耳种质资源的研究提供了科学依据[23]。RAPD标记的试验条件摸索和引物选择是十分关键而艰巨的任务，通过对试验条件的标准化，可以提高RAPD标记的再现性[24]。