大白菜枯萎病生防木霉菌的筛选及其防治效果

摘    要：为筛选对大白菜枯萎病具有生防潜力的木霉菌，采用对峙法和熏蒸法测定9株木霉菌株的拮抗作用，根据形态特征和ITS序列进行鉴定，并通过盆栽试验验证其对大白菜枯萎病的防治效果。结果表明，供试9株木霉菌对大白菜枯萎病菌均具有拮抗作用，其中菌株2019-1和2021-2表现较好，拮抗抑菌率分别为72.14%～87.18%和74.87%～81.42%；将菌株2019-1和2021-2分别鉴定为深绿木霉（Trichoderma atroviride）和哈茨木菌（T. harzianum）；盆栽试验结果表明，菌株2019-1和2021-2发酵液对大白菜枯萎病的防治效果分别为67.24%和64.87%。综上所述，菌株2019-1和2021-2防治大白菜枯萎病具有很大的潜力。

关键词：大白菜；枯萎病；木霉菌；鉴定；拮抗作用；防治效果

中图分类号：S634.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）01-013-06

Screening and control effect of Trichoderma against Chinese cabbage Fusarium wilt

SONG Yumeng， LIU Wenjie， HU Xichao， YUAN Zhonglin， LUO Lan

（College of Plant Health and Medicine， Qingdao Agricultural University/Shandong Engineering Research Center for Environment-Friendly Agricultural Pest Management， Qingdao 266109， Shandong， China）

Abstract： In order to screen the biocontrol potential of Trichoderma against Chinese cabbage Fusarium wilt， the antagonistic effect and control effect of nine Trichoderma strains were detected by plate confrontation and fumigation method. It was identified by its morphological characteristics and ITS sequence analysis， and its control effect on Chinese cabbage Fusarium wilt was verified by pot method. Results showed that nine Trichoderma strains had antagonistic effect on Chinese cabbage Fusarium wilt， among them， strain 2019-1 and 2021-2 showed better performance with antagonistic inhibitory rates of 72.14%-87.18% and 74.87%-81.42%， respectively. The strain 2019-1 and 2021-2 were identified as Trichoderma atroviride and T. harzianum， respectively. In the pot experiment， the control effect of the fermentation broth of 2019-1 and 2021-2 on Chinese cabbage Fusarium wilt were 67.24% and 64.87%， respectively. Taken together， strains 2019-1 and 2021-2 had the potential to control Chinese cabbage Fusarium wilt.

Key words： Chinese cabbage; Fusarium wilt; Trichoderma; Identification; Antagonism; Control effect

大白菜（Brassica rapa var. pekinensis）是我国重要的大众蔬菜，味道鲜美、营养丰富，在我国广泛种植，其栽培面积和产量居世界首位[1-2]。大白菜因其含有各种维生素、矿物质和纤维素，而具有保健作用[3]。然而，大白菜在生产过程中易受植物病原菌的侵染造成严重的产量和经济损失[4-5]，其中，大白菜枯萎病是由镰刀菌侵染引起的维管束病害，因其病原菌种类多且寄主广泛而危害严重，全国各地均有发生，严重时发病率在80%以上，造成植株大量死亡[6-8]，因此对大白菜枯萎病防治技术的研究尤为重要。

目前大白菜枯萎病的防治，以化学杀菌剂防治为主，采用抗耐病品种和田间轮作的农业措施为辅。化学杀菌剂虽然可以有效控制枯萎病的发生，但长期大量应用易造成农药残留、食品安全以及环境安全等问题[9-10]。开发对环境友好和诱导植株产生抗病性的生物防治方法具有广阔的应用前景。其中木霉菌（Trichoderma）广泛分布于土壤和根际生态系统，对环境适应能力强[11]。前人研究发现，木霉菌对黄瓜根结线虫[12]、水稻纹枯病[13]、苦瓜枯萎病[14]、番茄枯萎病[15]和草莓灰霉病[16]具有良好的防治效果，同时还具有促进番茄和黄瓜生长的作用[17-19]。然而未见木霉菌对大白菜枯萎病的防效报道。笔者从山东省青岛市胶州市大白菜田中分离获得木霉菌株，采用离体和盆栽方法测定木霉菌对大白菜枯萎病的拮抗作用与防治效果，以期为该病害的生物防治提供更多优质的菌种资源，为开展绿色防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：大白菜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），编号分别为BCFG1和BCFG2。木霉菌株的编号分别为2019-1、2020-2、2020-5、2020-6、2020-7、2021-1、2021-2、2021-3和2021-4，共9株，分离于大白菜根际。以上菌株由青岛农业大学植物医学学院农药学实验室保存备用。供试药剂：3×108 CFU·g-1哈茨木霉可湿性粉剂，为美国拜沃股份有限公司产品。

供试大白菜品种：精品胶白一号，由青岛市胶州市大白菜研究所育成，为中晚熟一代杂种，抗病、丰产、整齐、球形好，风味品质优、口感好、可密植、耐贮运。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15～20 g、蒸馏水1000 mL，用于拮抗木霉菌的筛选。麦粒培养基：麦粒50 g、蒸馏水100 mL浸泡24 h后灭菌，用于枯萎病菌和木霉菌孢子的培养。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌对大白菜枯萎病的离体抑菌活性测定 试验于2021年5－9月在青岛农业大学植物医学学院农药毒理学实验室进行。采用平板对峙法测定木霉菌对大白菜枯萎病菌的拮抗作用[20]。将直径5 mm的木霉菌菌饼放置于PDA平板中距离中心点2.5 cm的一端，在另一侧距离中心点2.5 cm处放置相同大小的大白菜枯萎病菌菌饼，以无菌空白PDA菌饼作为对照，3次重复，放于28 ℃恒温培养7 d后，采用十字交叉法测量对照组和处理组大白菜枯萎病菌菌落半径并计算抑菌率。

采用平板倒扣法测定木霉菌对大白菜枯萎病菌的熏蒸作用[21]。将直径5 mm木霉菌菌饼接于PDA平板中央，另一平板中央接相同大小的大白菜枯萎病菌菌饼，将两平板对扣，木霉平板在下方，封口膜密封。以接种大白菜枯萎菌而不接木霉菌的平板倒扣作空白对照。3次重复，28 ℃恒温培养5 d后，采用十字交叉测量各处理的大白菜枯萎病菌菌落直径，计算抑菌率。

1.2.2 拮抗木霉菌株的鉴定 形态学鉴定：将拮抗作用较好的菌株分别接种到PDA培养基上，28 ℃恒温培养，观察各菌株菌落形态特征。待产生孢子后，在显微镜下观察其形态特征，参照相关文献资料[22]进行分类学鉴定，初步明确病原菌的分类地位。

分子生物学鉴定：分别提取木霉菌株的DNA，采用真菌的通用引物（ITS1和ITS4）进行PCR扩增[23]。采用25 μL PCR反应体系：ddH2O 17.25 μL、10×Easy Taq Buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA 1 μL、Easy Taq DNA Polymerase 0.25 μL。反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，34个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程有限公司测序，以测得序列为索引，在NCBI数据库中进行Blast比对分析。选择同源性较高的序列用MEGA软件的UPGMA法构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

1.2.3 拮抗木霉菌对大白菜枯萎病的盆栽防效  采用灌根的盆栽法测定木霉菌发酵液对大白菜枯萎病的防治效果[24]。试验于2021年8—11月在光照培养箱中进行，温度（25±1） ℃，相对湿度60%～70%，光照周期为16 h光照/8 h黑暗。用250 mL锥形瓶麦粒培养基分别培养病原菌BCGF1、BCGF2和木霉菌株2019-1和2021-2。待其产孢后，用灭菌水配成孢子悬浮液。采用灌根法按每杯接入10 mL浓度105 CFU·g-1土孢子液（BCGF1和BCGF2各5 mL）培育1 d后，选取大小一致，健康正常的具有2片真叶的白菜幼苗按1株/杯移栽至接种致病菌的直径7.0 cm高度7.5 cm太空杯中，用孢子浓度为108 CFU·mL-1的菌株2019-1和2021-2发酵液按每杯10 mL灌根，以微生物杀菌剂哈茨木霉WP200倍液为药剂对照，同时设不接枯萎病菌和只接枯萎病菌为阴性对照和阳性对照。太空杯均放入长45 cm、宽30 cm的塑料托盘中，每处理10株，3次重复，随机区组排列。常规管理，20 d后调查各处理白菜幼苗的株高、根长和鲜质量及发病情况并计算病情指数和防治效果[25-26]。

1.3 数据分析

抑菌率/%=（对照组菌落直径－处理组菌落直径）/（对照组菌落直径－菌饼直径）×100。

病情指数=Σ（各级病株数×相对级数值）/（调查总株数×最高病级）×100。

防治效果/%=[（空白对照病情指数－处理病情指数）/空白对照病情指数]×100。

试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 木霉菌对大白菜枯萎病的离体抑菌活性

供试的9株木霉菌对2株大白菜枯萎病菌均有一定抑制作用（表1）。9株木霉菌对大白菜枯萎病菌BCGF1和BCGF2的抑制率分别在51.49%～81.42%和41.54%～87.18%，其中以菌株2021-2和2019-1的拮抗作用较强（图1）。9株木霉菌对大白菜枯萎病菌BCGF1和BCGF2的熏蒸抑制率分别在5.98%～22.97%和9.16%～21.91%，以菌株2020-6和2021-1的熏蒸作用最强（图2）。

2.2 拮抗木霉菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定 由图3可以看出，菌株2019-1菌落由白色至浅黄色至绿色，平铺在培养基上，呈同心轮纹状排列，具有清新的芳香气味。分生孢子梗垂直对生或互生，分生孢子绿色、近球形、大小3.2～4.5 μm（n=20）；菌株2021-2菌落黄绿色，菌丝不太丰富，平铺在培养基上，孢子粉很多呈球状。分生孢子梗分支不规则，单生或对生，较少单生，呈帚状瓶颈形，浅绿色至绿色，分生孢子椭圆形，大小2.5～4.0 μm（n=20）。