一种新的广适性大白菜杂交种纯度分子鉴定方法的研究

摘    要：以往进行大白菜杂交种分子纯度鉴定，需要基于亲本开发相应的分子标记，有基因型依赖性。笔者以大白菜杂交种基因组DNA为模板，分别基于自交不亲和S单元型多态性开发的BrCI引物、BrCII引物进行PCR扩增，根据扩增产物的电泳结果确定该大白菜商品杂交种纯度；当杂交种亲本分别为I类S单元型和II类S单元型时，筛选以BrCI和BrCII引物分别扩增后的产物中只有一个出现条带的材料即为假杂种；当亲本同时为I类S单元型或II类S单元型时，用限制性内切酶Hinf I或Alu I对PCR产物进行酶切，筛选酶切产物中电泳条带的带型显著不一致的材料为假杂种。该方法为一种新的广适性大白菜杂交种纯度分子鉴定方法，利用该方法进行纯度鉴定，整个周期只需2～3 d，快速精准。

关键词：大白菜；S单元型；广适性；分子标记；纯度鉴定；酶切

中图分类号：S634.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）02-019-10

A novel molecular marker method with broad application for hybrid purity testing of Chinese cabbage

WEI Xiaochun1， YUAN Yuxiang1， ZHAO Yanyan1， WANG Zhiyong1， YANG Shuangjuan1， SU Henan1， DONG Xiaobing1， LI Lin1， YAO Chunling2， ZHANG Xiaowei1

（1.Institute of Horticulture， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2.Yanling Ganluo Health and Old-age Care Co.， Ltd.， yanling 461200， Henan， China）

Abstract： In the past， molecular marker testing of hybrid purity of Chinese cabbage needs to first develop molecular markers based on parents， which are genotype dependent. In this study， the genomic DNA of Chinese cabbage hybrids was used as template， and the amplified products were obtained by PCR amplification with BrCI primer pairs and BrCII primer pairs respectively. The parental type of the commercial hybrids of Chinese cabbage was determined according to the electrophoresis result of the amplified product. When the parents were BrCI S locus and BrCII S locus respectively， only the material with single band was the homozygous parent of the amplification products amplified with BrCI primer pair and BrCII primer pair respectively. When the parents were both BrCI S locus or BrCII S locus， restriction endonuclease Hinf I or Alu I was used for enzyme digestion， and the material with significantly inconsistent electrophoretic bands in the enzyme digestion products was scored as suspected homozygous material. The whole cycle development of this new method only takes 2-3 days， which is fast and accurate.

Key words： Chinese cabbage; Slocus; Molecular marker; Purity testing; Restriction enzyme

种子纯度是种子主要的质量指标，纯度降低会导致减产甚至有可能抵消一个新品种的增产潜力[1]。在种子生产和销售过程中，由于不够重视鉴定种子的品种真实性和品种纯度，因此往往会给农业生产造成巨大的经济损失[2]。目前杂交种纯度的鉴定一般是采用田间形态学鉴定法（幼苗形态鉴定）、蛋白质电泳鉴定法和DNA分子标记鉴定法[1]。田间形态学鉴定法检测需要完成一个营养生长期，所需时间长，生产的杂交种要等到下一个季节或者异地鉴定后才能够得到结果，而且鉴定结果容易受到当地各种环境因素的影响，其准确性难以把握[1]。鉴于形态学方法的弊端，采用一种快捷、准确度高、实用性强的室内检测方法来代替田间形态学鉴定法是必然的。

随着分子生物技术的不断进步，分子标记技术已经成为检测作物杂交种纯度真实且可靠的方法。DNA分子标记技术不需要考虑组织的特异性，也不受外界环境的影响，鉴定准确、稳定，重复性好，已成为更有前景的方法[3]。钟开勤等[2]利用SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性）标记技术，建立福春1号大白菜的DNA指纹图谱，分子标记鉴定结果与常规田间形态学鉴定结果吻合，用于大白菜纯度鉴定快速且准确。宋顺华等[4]采用AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）技术，从20对引物组合中筛选出组合E-ACA/M-CTG，能将供试的90个大白菜品种全部区分开来；同时用该引物组合检测2个大白菜商品种（北京新2号，京夏王）的纯度，除1个单株外，其AFLP标记是非常一致的。对比田间性状调查结果，认为AFLP技术对杂交种纯度鉴定的结果可靠。杨晓云等[5]利用SSR（simple sequence repeats，简单序列重复）共显性分子标记P3鉴定青研早9号、青研桔15和青研春白一号3个大白菜杂交种的纯度，与田间性状调查结果对比发现，该标记鉴定的结果可靠。赵新等[6]应用SSR分子标记及高分辨率溶解曲线技术（high-resolution melting，HRM）筛选出用于大白菜杂交纯度鉴定的复合SSR位点，复合EST-SSR标记对秋绿75、津秋78和秋绿60等10份大白菜杂交种进行纯度鉴定，能够很好地进行杂交种纯度鉴定，且通过一次PCR反应能够同时检测到3个不同的多态性位点。张庶等[7]利用3对EST-SSR引物（BRE28、BRE121和BRE131）对13个大白菜品种（夏白1号、夏白45等）进行纯度鉴定，其扩增产物都表现出双亲互补带型，而且带型间的大小差异明显，能够很好地区分杂交种和亲本，可以快速、准确地鉴别大白菜杂交种纯度。薛银鸽等[8]利用InDel标记（insertion and deletion，插入/缺失）引物组合BrID90107和BrID10667可以将豫新四号与其亲本完全区分开来，可以有效鉴别大白菜杂交种纯度。

自交不亲和性（self-incompatibility）普遍存在于被子植物中，是防止植物近亲繁殖、保持遗传变异的一种重要的遗传机制[9]。芸薹属植物属于典型的孢子体型自交不亲和类型，其在遗传上由一个具有复等位基因的高度多态性的S位点控制[10-11]，每一个S位点被称为一个S单元型（S haplotype），根据S位点基因序列的相似性，可将芸薹属自交不亲和等位基因分为两大类：I类和II类[12]。在花粉中，I类S单元型对II类S单元型均表现为显性[13]。I类S单元型具有较强的自交不亲和性，而II类S单元型的具有一定的自交亲和性。大白菜（Brassica rapa ssp. pekinensis）是十字花科芸薹属异花授粉作物，充分利用杂种优势主要途径之一是自交不亲和系制种。目前大白菜杂交种主要采用自交不亲和性制种，杂种率达不到100%，且其为异花授粉作物，由于自交不亲和性也受到温度等环境因素影响，时常会出现亲本有极少量自交结实现象，因此对大白杂交种进行纯度鉴定是非常必要的[14]。

对大白菜杂交种纯度鉴定的方法，以往的经验就是将所生产的杂交种，加上2个亲本，按照一定的数量进行穴盘基质育苗，进行表型观察。而进行分子标记纯度鉴定时，首先需要基于亲本开发相应的分子标记，有基因型依赖。利用大白菜自交不亲和系制种的亲本可以分为3种情况，2个亲本分别为I类和II类自交不亲和系，同时为I类自交不亲和系或同时为II类自交不亲和系。有鉴于此，笔者的研究目标是提供一种广适性的大白菜杂交种纯度鉴定的方法，将PCR扩增和酶切筛选结合，精确度高、用时短。利用自交不亲和S等位基因的保守性设计PCR扩增引物，进行商品杂交种的S单元型区分；同时，对鉴定结果为同一类型的S单元型利用不同的限制性内切酶进行区分，进而快速准确进行纯度鉴定，整个周期只需2～3 d，快速精准。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2019年12月至2020年11月在河南现代农业研究开发基地开展，豫新9号（母本Y358-10为I类S单元型S9，父本Y177-28为II类S单元型S40）、豫新58（母本Y195-93为I类S单元型S45，父本Y66-9为I类S单元型S46）及优选组合Y663-8×G90E16（母本Y663-8为II类S单元型S60，父本G90E16为II类S单元型S40）为河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜研究室自育品种，按照株行距50 cm×60 cm定植到田间，每个材料288株。27份大白菜材料由河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜研究室收集保存，利用穴盘基质育苗方式进行育苗，每个材料96株。后期试验验证时，将生产的大白菜杂交种利用培养皿进行催芽。用改良后的CTAB法整株提取萌发种子DNA[15]。

1.2 自交不亲和复等位基因多序列比对

根据NCBI上自交不亲和基因（S locus）的序列，进行核苷酸水平比对分析。I类S单元型包括：S61（AB298887.1）、S55（AB298885.1）、S35（AB298877.1）、S32（AB298876.1）、S54（AB219162.1）、S46（AB013718.2）、S12（D38564.2）、S22（AB054061.1）、S8（D38563.1）、S52（AB298883.1）、S38（AB298879.1）、S21（AB270775.1）、S45（AB012106.1）、SRK-f2（AB190354.1）、S53（AB298884.1）、S9（D30049.1）、S47（AB180899.1）。II类S单元型包括：S40（AB211197.1）、S60（AB097116.1）、S44（AB211198.1）、S29（AB008191.1）[16]。

1.3 聚合酶链式反应（PCR）

根据I类和II类S单元型序列设计引物I类S单元型引物，上游引物BrCIF：5’-GATGARTTTATGAATGAGGTGA-3’，下游引物BrCIR：5’-CTGAGCAGGTGTACTKGTTCACCG-3’；II类S单元型引物，上游引物BrCIIF：5’-GGAAGGTTAGTTGACGGGCAAG-3’，下游引物BrCIIR：5’-GACGCTCGGTAATATGATAGTC-3’。PCR反应体系总体积为20.0 μL，含有Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0）10.0 μL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol·L-1），2.0 μL DNA模板（40 ng·μL-1），7.0 μL的灭菌水，试剂购自Takara公司。PCR扩增程序包括：94 ℃变性2 min；35个循环，每循环94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（Bioweste Agarose琼脂糖，北京）PCR扩增产物。

1.4 限制性内切酶反应

根据PCR扩增结果，对杂交种的纯合亲本为同一类S单元型时，分别用限制性内切酶Hinf I（I类S单元型）和Alu I（II类S单元型）进行消化[17-19]。酶切反应体系为20.0 μL，含有10.0 μL的灭菌水，2.0 μL的10×内切酶缓冲液，1.0 μL的Hinf I或Alu Ⅰ酶（10 U）及10.0 μL的PCR产物，试剂购自Takara公司。反应体系于37 ℃条件下消化16 h，3.0%琼脂糖凝胶电泳分离（购自Lonza，美国）。

1.5 大白菜商品杂交种纯度鉴定

通过各类型的鉴定方法进行纯度鉴定，根据所鉴定出的纯合体数量，计算各组合/商品种的杂合体比例，即纯度，计算公式如下：

纯度%=（检测总量-纯合体数量）/检测总量×100。

2 结果与分析