薄荷内生细菌X7的分离鉴定及其对番茄黄萎病的防效

摘 要：为探寻高效防治番茄黄萎病（Verticillium dahliae）的薄荷内生优良菌株，首先采用平板划线法分离纯化薄荷根、茎、叶的内生菌，然后采用平板对峙培养法分析内生菌对葡萄座腔菌、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄萎病菌、串珠镰刀菌5种病原菌的抑菌特性，并根据病原菌的形态特征、生理生化特征和16S rDNA测序鉴定内生菌的分类；利用盆栽试验分析内生拮抗菌对番茄黄萎病的防效。结果表明，从薄荷上获得25株内生菌株，其中菌株X7和X9具有广谱抗性，尤其是对黄萎病菌的抑制效果最为明显，抑菌率分别为73.33%、70.62%；菌株X7被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）；盆栽试验表明，X7有效降低了番茄黄萎病的发病率和病情指数，防治效果达67.16%。来自薄荷的贝莱斯芽孢杆菌X7是一株具有生防潜力的菌株，可用于番茄黄萎病的生物防治。

关键词：薄荷；内生细菌；贝莱斯芽孢杆菌；番茄黄萎病；生物防治

中图分类号：S641.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）02-029-06

Screening and biological control of mint endophytic bacterium X7 against tomato Verticillium wilt

ZHANG Qingchen1，LIU Yingmin2，ZHU Xiaoqin1，HAN Shuang1，HUANG Mengqing1，PEI Dongli1

（1. College of Biology and Food， Shangqiu Normal University/Henan Provincial Engineering Research Center for Development and Appllication of Characteristic Microorganism Resources， Shangqiu 476000， Henan， China; 2.School of Chemistry and Chemical Engineering， Shangqiu Normal University， Shangqiu 476000， Henan， China）

Abstract： The objective was to find an effective strain from mint for biological control of tomato Verticillium wilt. Firstly， the endophytic bacteria from root， stem and leaf of mint were isolated and purified by plate marking. Furthermore， the inhibitory effect of endophyte on mycelial growth of five pathogens， including Botryosphaeria dothidea， Fusarium oxysporum， F. graminearum， Verticillium dahlia and F. verticillioides was studied in dual cultures on PDA plates. The endophytic antagonists were identified according to morphological， physiology and biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing. The biological control effectiveness of endophytic antagonists against V. dahlia was analyzed by pot cultivation. The results showed that 25 endophytic strains were isolated and purified from mint， among which X7 and X9 had broad spectrum effectiveness， especially against V. dahlia， with inhibition rates of 73.33% and 70.62%， respectively. The strain X7 from mint was identified as Bacillus velezensis. Moreover， pot experiment showed that strain X7 effectively reduced the incidence and disease index of V. dahlia， and the control effectiveness reached to 67.16%. The above results demonstrate that B. velezensis X7 is a promising biological control agent to suppress Verticillium wilt in tomato.

Key words： Mint; Endophyte; Bacillus velezensis; Verticillium dahliae; Biological control

植物内生细菌（Endophyte）是定殖在健康植物组织内部，并与植物建立共生关系的一类微生物[1]。已有研究表明，植物内生菌最早发现于禾本科植物，如牧草等，现已发现广泛存在于至少80个属的290多种禾本科植物中，重要的经济林木如针叶类（冷杉、云杉、红杉、松、柏等）、阔叶类（栎树、桦树、桉树等）、灌木、草本植物以及栽培作物、果树、藻类和蕨类植物[2]。大量有益的内生菌在植物体内能产生营养物质（内生共生固氮）、激素等物质，参与植物的代谢过程，能够促进植物生长和增强植物抗逆、抗病、抗虫等能力[3]，这些特性引起了植物学家、植物生理学家、植物病理学家的高度关注。

薄荷（Mentha canadensis）为唇形科（Lamiaceae）薄荷属（Mentha）多年生草本中药材。薄荷中包含多类化合物如精油、多酚类、黄酮类等，被广泛地应用于抑菌[4-5]、抗病[6-7]、抗肿瘤[8]。截止到目前，薄荷内生菌的研究主要是内生细菌多样性及组成分析[9-10]，内生真菌筛选及多样性分析[11-12]，有关薄荷内生菌对植物促生、生物防治方面的研究鲜有报道。笔者从薄荷上分离并鉴定内生细菌，分析内生菌对不同病原菌的广谱抗性，同时对获得的拮抗菌进行鉴定，并进一步探讨拮抗菌对番茄黄萎病的生物防效及其生理机制，旨在为微生物菌剂的研发提供生防菌种和番茄黄萎病生物防治的分子机制研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、禾谷镰刀菌（F. graminearum）和黄萎病菌（Verticillium dahliae）由商丘师范学院植物与微生物互作重点实验室提供，串珠镰刀菌（F. verticillioides）由河南农业大学提供。

2020年5月对示范园区温室内健康无病的薄荷（Mentha canadensis）进行内生细菌的分离，2022年4月对室内盆栽的Moneymaker番茄进行生物防效相关指标的测定。薄荷（Mentha canadensis）、Moneymaker番茄由商丘师范学院植物与微生物互作重点实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 薄荷内生细菌的分离、纯化与形态学观察  将新鲜无病薄荷的根、茎和叶用流水冲洗，室温晾干。用75%（[φ]，后同）乙醇消毒1 min后无菌水冲洗5次，再用2% NaClO溶液浸泡1 min后无菌水冲洗5次。将消毒后的根、茎、叶分别加适量无菌水，研磨至匀浆，静置10 min，吸取100 μL涂布于溶菌肉汤（LB）固体培养基平板，以最后一次的无菌水作对照。37 ℃恒温培养箱培养1～3 d，用接种环分别挑取平板中不同形态、大小、颜色等的菌落，平板划线纯化后获得单菌落，并对纯化后的单菌落进行形态学观察。

1.2.2 薄荷内生拮抗细菌的筛选 采用平板对峙培养法，以5个供试菌株为病原菌，挑取病原菌菌饼置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板中心，于其周围同等距离（约距中心2.3 cm）3处接种待筛薄荷内生细菌，以不接内生细菌作对照。于28 ℃恒温倒置培养，待对照的病原菌长满平板（直径为9 cm）时，观察对峙平板薄荷内生细菌对病原菌的抑菌效果；利用病原菌与内生细菌两点划线法，测量对峙平板的病原菌向内生细菌扩展的距离，即处理菌落半径，并按下列公式计算抑菌率[13]，每个薄荷内生细菌对单一病原菌的抑菌率均由其3个对峙平板计算，每个对峙平板测定3个数据，即9次重复。经筛选获得拮抗作用较好的菌株做进一步试验。

抑菌率/%=[对照菌落半径-处理菌落半径/对照菌落半径×100。                                                                     （1）

1.2.3 薄荷内生拮抗细菌生理生化鉴定 参照赵诗佳等[14]的方法对薄荷内生拮抗细菌菌株进行革兰氏染色试验、淀粉水解试验、吲哚乙酸试验、甲基红试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验，参照东秀珠等[15]的方法对薄荷内生拮抗细菌菌株进行乙酰甲基甲醇试验（V-P test）和乳糖、甘油、柠檬酸盐利用试验，参照夏明聪等[16]的方法测定薄荷内生拮抗细菌菌株生防特性相关的β-1，3葡聚糖酶活性和蛋白酶活性。参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《伯杰细菌鉴定手册》[17]对薄荷内生拮抗细菌菌株进行初步鉴定。

1.2.4 X7菌株分子生物学鉴定 提取拮抗细菌基因组DNA，利用Mastercycler® nexus PCR仪对其16S rDNA进行PCR分析。所用引物为：fD1（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和rP1（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR反应体系为50.0 μL：模板DNA 50～80 ng、上下游引物（10 μmol·μL-1）各1.0 μL、dNTP 5.0 μL、buffer（Mg2+）0.5 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O补至50.0 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，委托南京金斯瑞生物科技有限公司对产物进行测序。所测序列递交GenBank，并通过BLASTn对测定16S rDNA基因序列进行同源性分析，利用MEGA 5.0软件基于邻接法（Neighborhood Joining）构建系统进化树。

1.2.5 X7菌株对番茄黄萎病的生物防效测定 取健康饱满的番茄种子消毒后，将番茄按照表1进行3种不同处理，即对照组、致病组、防病组。试验采用室内盆栽方式，按照表1伤根法对长至5～6片真叶的番茄植株接种黄萎病病原菌，处理至20 d调查番茄的发病率，并按下列公式分别计算病情指数[18]和防治效果，每个处理3次重复，每次重复10盆，每盆种植1株。发病程度分级标准参照陆家云等[19]的标准。0级：外部无症状，植株健康；1级：病叶面积占总叶片的10%以下，叶脉间黄化；2级：病斑面积占总叶片的10%～50%，叶脉变黄且萎蔫；3级：病叶面积占总叶片的50%以上，整株萎蔫；4级：植株死亡。