蔬菜根结线虫生防菌淡紫紫孢菌研究进展

摘    要：根结线虫病已成为我国蔬菜产业健康可持续发展的瓶颈问题。淡紫紫孢菌是多种植物线虫及病原菌的重要天敌，是极具推广潜力的生防菌。简要介绍了根结线虫的危害，着重阐述了淡紫紫孢菌对根结线虫的致病机制，并对其抵御其他病原菌和虫害、定殖影响因子、发酵工艺等研究进行了综述，最后对淡紫紫孢菌的分子机制、次级代谢产物及核心微生物组等研究提出了展望，以期为破解蔬菜根结线虫防治技术壁垒提供一定的思路。

关键词：淡紫紫孢菌；根结线虫；作用机制

中图分类号：S63+S432.4+5 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）03-001-08

Advances in study on Purpureocillium lilacinum-biocontrol strain of vegetable root-knot nematode

YANG Fan1， JIANG Huayan1， CAI Yuxin2， TANG Yanling1， MA Kai1， SHI Xuanjie1， CHANG Gaozheng1， LIU Jingtang3

（1. Institute of Horticulture， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Henan Qingfa Seed Industry Co.，Ltd.， Zhengzhou 450002， Henan， China; 3. Henan Seed Industry Development Center，Zhengzhou 450046， Henan， China）

Abstract： Root-knot nematode disease has become a bottleneck of the sustainable and healthy development of vegetable industry in China. Purpureocillium lilacinum is an important natural enemy of a variety of plant nematodes and pathogens， and is a biocontrol and functional fungus with great promotion potential. In this paper， the damage of root-knot nematodes was briefly introduced， and the pathogenic mechanism of P. lilacinum on root-knot nematodes was emphatically expounded， the resistance to other pathogens and insect pests， colonization factors and fermentation technology were reviewed. Finally， the molecular mechanism， secondary metabolites and core microflora of P. lilacinum were prospected， so as to provide some ideas for breaking the technical barriers of vegetable root-knot nematode control.

Key words： Purpureocillium lilacinum; Root-knot nematode; Interaction mechanism

自Berkeley[1]首次报道根结线虫以来，根结线虫已是全球性难以控制和防治的土传病害，可以感染3000多种植物，包括蔬菜、豆类、谷物、杂草、灌木和果树以及草本和木质观赏植物等，其中侵染瓜类、茄果类、十字花科类等作物最为严重，当无寄主存在时，可在土壤中存活1年以上[2]。世界范围内大约有14%的植物损伤都是由线虫造成的[3-4]。相关数据显示，植物根结线虫一般造成经济作物减产22%～55%，严重时甚至导致绝收，世界上每年因根结线虫病造成经济作物损失高达1800亿美元[5]。经调查，我国蔬菜根结线虫以南方根结线虫和爪哇根结线虫为主，造成黄瓜[6]、辣椒[7-8]、番茄[9]等经济作物损失尤其严重，常年发病率一般为11%～35%，严重时可达75%，甚至绝收。20世纪50年代最早在山东和河南发现根结线虫，半个世纪以来，全国各地均有根结线虫发生，且危害日趋加重，尤其是黄淮海地区常年种植的设施及保护地根结线虫极为泛滥[5，10-11]。根结线虫在作物根部形成根结，破坏作物根系对水分、矿物质及养分的吸收，导致作物生长受阻，加剧植株减产或死亡[12]。此外，土壤中病原微生物易通过作物根部伤口侵入，形成复合侵染，协同加重根结线虫病发生，造成更大损失[13]。相关研究表明，根结线虫会加重枯萎病、蔓枯病及冠瘿病的发生[14]。当前对根结线虫病防治最经济简单和有效的方法依然是化学药剂防治，但在线虫防治过程中易出现农药残留、环境污染、线虫产生抗性、土壤中微生物种群数量失衡、人畜共存受到威胁等问题[6，13，15]。因此，如何安全、高效、环境友好地防治根结线虫病的发生已成为设施蔬菜高效生产急需攻克的重大卡脖子难题。

1 淡紫紫孢菌防控蔬菜根结线虫作用机制

近年来环保、高效、对非靶标生物低毒的杀线微生物被广泛研究[16-17]。淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）2011年前又名淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus），Jennifer等[18]通过扩增其ITS、18S rDNA和TEF 3个序列，将其划分为粪壳菌纲（Sordariomycetes），肉座菌目（Hypocreales），蛇形虫草科（Ophiocordycipitaceae），紫孢霉属（Purpureocillium）。淡紫紫孢菌作为多种植物根系内生习居菌，可以寄生及毒杀根结线虫、异皮线虫、剑线虫、金色线虫、穿孔线虫、螺旋线虫、珍珠线虫、肾形线虫和孢囊线虫等多种植物线虫，还能抑制多种植物病原真菌及植物病原细菌和昆虫病原体等，克服了传统化学药剂带来的诸多弊端，具有安全无污染性、流行触杀性、环境友好等特点，是极具推广潜力的生防菌[19-22]。袁梦蕾等[23]通过在黄瓜育苗基质中添加淡紫紫孢菌微菌核，大田移栽30 d后，黄瓜根结线虫防效达80%。杨凡等[24]前期研究发现，淡紫紫孢菌pt 361菌株对黄瓜根结线虫卵寄生率达72.61%，菌株混合发酵液对黄瓜根结线虫幼虫致死率达95.20%。还有研究表明，淡紫紫孢菌和粉红螺旋聚孢霉菌株联合使用，温室黄瓜根结线虫防效显著高于单一菌株使用效果[25]。

迄今为止，关于淡紫紫孢菌防控根结线虫作用机制研究鲜有报道[26]。在查阅、参考已有淡紫紫孢菌研究文献的基础上，结合笔者前期对淡紫紫孢菌菌株Pl36-1及突变菌株分析研究，认为淡紫紫孢菌主要通过菌丝寄生、胞外酶降解及产生毒素毒杀等3种方式作用于根结线虫卵或幼虫。

1.1 菌丝寄生

淡紫紫孢菌主要通过菌丝侵入并寄生植物根结线虫卵和幼虫。Jatala[27]首次报道并证明了这一现象。Dackman等[28]从植物根部南方根结线虫卵囊和幼虫中分离得到了多株淡紫紫孢菌菌株，通过盆栽复接试验发现这些菌株均能再次寄生或侵染根结线虫卵囊和2龄幼虫。高学彪等[29]利用淡紫紫孢菌侵染南方根结线虫卵，寄生率为92.60%。Holland等[30]研究表明，淡紫紫孢菌通过菌丝膨大形成吸附胞和侵入钉侵入爪哇根结线虫卵囊、卵、幼虫和雌虫成虫，并在体内繁殖生长。杨凡等[24]发现，淡紫紫孢菌菌丝接触植物根结线虫卵囊、卵和幼虫等表面产生特殊结构（吸附胞），从而吸附在根结线虫卵囊、卵壳表面和幼虫表皮，其次接触菌丝吸附胞末端凸出，生长形成侵入钉，通过机械压力直接穿刺侵入卵囊、卵壳或幼虫表皮后继续生长向四周扩展。刘国坤等[31]采用扫描电镜观察发现，随着淡紫拟青霉接种时间延长，根结线虫卵壳内菌丝增多。接种5 d后，卵壳表面菌丝呈网状密集生长，卵出现畸形缢缩，接种7 d后，根结线虫未成熟的卵（胚胎发育期）比成熟的卵更易被淡紫紫孢菌侵染，其胚胎发育期卵寄生率为98.20%，成熟卵寄生率为88.63%，原因还不清楚。Khan等[32]在多种线虫研究中也证明了淡紫紫孢菌菌丝形成侵入结构直接穿透线虫体壁或卵壳，从而侵染寄生根结线虫卵和幼虫。在相关功能基因挖掘方面，谢家廉[33]发现预测了淡紫紫孢菌中有357个基因与菌丝附着胞形成有关，并且在侵染过程中起主要作用。后期随着分子生物学及新技术发展，将会逐步揭开淡紫紫孢菌菌丝侵染线虫卵和幼虫的作用机制。

1.2 胞外酶降解

淡紫紫孢菌除了菌丝寄生根结线虫卵或幼虫外，还会分泌甘露聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、几丁质酶、β-葡聚糖苷酶、脂质降解酶等胞外酶，降解根结线虫卵壳或线虫表皮核黄素、几丁质层、脂质层及相关蛋白，帮助菌丝穿透卵壳或幼虫体壁，进而影响根结线虫卵孵化或幼虫生长发育。张雯等[34]、肖炎农等[35]、张春龙等[36]研究发现，淡紫紫孢菌发酵液产生的几丁质酶，可以降解线虫体壁和卵壳，对根结线虫幼虫有一定的抑制和致死作用。Bonants等[37]研究表明，丝氨酸蛋白酶有助于淡紫紫孢菌穿透线虫卵或幼虫体壁，并有研究者[38]将编码丝氨酸蛋白酶基因Ver112转入淡紫紫孢菌中，杀线虫活性显著增强。Yang等[39]研究表明，淡紫紫孢菌产生磷脂酶D可以降解线虫卵壳和幼虫表皮，同时发现线虫卵壁或幼虫表皮可以诱导pld基因表达。Khan等[32]通过透射电镜观察表明，几丁质酶可水解线虫卵细胞卵黄层，几丁质层出现大空泡，从而暴露脂质层；丝氨酸酶则与脂质层等发生反应，使脂质层彻底消失，几丁质层大量水解，最终导致卵细胞死亡。赵培静等[40]采用Folin-酚法和DNS法研究了淡紫紫孢菌发酵液中几丁质酶和蛋白质酶活力，发现几丁质酶产酶达到顶峰时间比蛋白质酶早，同样几丁质酶活性比蛋白酶要高，原因与培养基中添加壳聚糖和蛋白胨的量有关。还有报道指出，淡紫紫孢菌产生新型葡糖苷酶（α-glucosidase）、乙酰胆碱酯酶等酶类水解糖类和脂类，从而降解线虫体壁和卵[20，41-43]，致死线虫和抑制卵孵化，其作用机制有待深入研究。

1.3 毒素毒杀

淡紫紫孢菌还可分泌产生一些相关毒性次级代谢产物或毒素麻痹毒杀线虫。有学者从淡紫紫孢菌发酵液中分离出了可以直接影响线虫卵、幼虫和雌虫生长发育的代谢产物醋酸，浓度为0.044 mol·L-1时，显著抑制线虫活性[44]。白灰制菌素（Leucinostatin）作为线虫活性指示剂，是一类九环脂肽类活性物质，由白灰制菌素A、B、C、D、F、H、S和K等组分组成[19-20，45]。杨凡等[24]通过对淡紫紫孢菌pt361发酵液检测分析认为根结线虫幼虫致死率和白灰制菌素的产生有关。Yang等[46]首次阐明了Zn（II）2Cys6转录调控蛋白rolP在侵染线虫早期上调表达，具有促进白灰制菌素A和抑制白灰制菌素B合成的作用，并报道了白灰制菌素A对幼虫具有强烈致死作用，对卵寄生影响不显著。崔香等[47]从淡紫紫孢菌发酵液中分离了7种脑苷脂类活性物质，具有抗植物寄生线虫、抗肿瘤及肝细胞损伤等作用，同时还能诱导孢子或子实体形成、细胞分化等。还有研究表明，从淡紫紫孢菌中分离的白僵菌素、麦角甾醇、Ｄ-甘露糖醇等通过细胞毒性、免疫抑制、细胞凋亡等作用于植物线虫幼虫[48]。

淡紫紫孢菌主要通过菌丝机械压力、胞外酶降解及毒素或代谢产物麻痹毒杀等一种或多种方式协同作用于植物寄生线虫卵或幼虫。还有学者认为淡紫紫孢菌受周围根际环境因子变化或线虫效应子等识别信号刺激，导致淡紫紫孢菌等有益菌群在根际大量定殖和代谢产物增多，导致线虫卵及幼虫被寄生或杀死[49]。下一步笔者将结合高通量测序、基因组学等现代分子生物学技术揭示淡紫紫孢菌防病关键因子，攻克淡紫紫孢菌寄生植物根结线虫卵和幼虫技术卡点等难点，为进一步阐明其作用机制奠定基础。

2 淡紫紫孢菌定殖

淡紫紫孢菌能否大量在靶标植物根部定殖、生长及其能否驱动或抑制植株根际土壤微生物群关系到田间防效的稳定、持久。淡紫紫孢菌被证明在白木香[50]、大豆[51]、黄瓜[23]等作物根内、根表皮及皮层细胞内部均可定殖。成儒萍等[52]研究表明，淡紫紫孢菌PL221在施入作物根际20 d后，菌株孢子数量显著高于施入土壤的初始数量106个·g-1；但随着时间延长，孢子数量逐渐降低。潘江禹等[53]发现，淡紫紫孢菌和固体发酵物拌土混施大田较菌剂单独直接施入大田更有利于淡紫紫孢菌孢子在根际周围存活。杨凡等[24]在淡紫紫孢菌定殖土壤研究中发现淡紫紫孢菌固体发酵物在土壤中存活60 d后，孢子含量仍在106个·g-1以上。也有研究报道淡紫紫孢菌和虾壳粉、牛粪、鸡粪或农用粪肥一起施用可促进淡紫紫孢菌生长和产孢，提高淡紫紫孢菌根际定殖能力，使其长期保持种群优势[54-55]。前人研究发现，淡紫紫孢菌施入土壤的浓度过低，易受其他微生物抑制或拮抗，无法抵达植物根部定殖和存活，不能在根际形成优势菌群，起不到防病促生和抑制有害微生物的作用[51，54]。此外，菌株对农药耐药性也是菌株能否田间大量定殖的主要原因，Yang等[56]通过紫外线诱变获得耐多菌灵50、100 μg·mL-1的淡紫紫孢菌突变菌株，大田定殖及根结线虫防效试验结果稳定，且阐明了β-tubulin基因位点改变与菌株耐多菌灵的关系。淡紫紫孢菌在土壤中虽分布广泛，但不同寄主品种、栽培措施、操作制度等导致土壤中环境多变，淡紫紫孢菌田间定殖效果不稳定，因此需深入研究以揭示影响淡紫紫孢菌定殖的主要因子，筛选驯化适宜田间大量定殖生长的生防菌株。