辣椒炭疽病菌Colletotrichum nigrum鉴定、生物学特性及药剂敏感性研究

摘    要：对2021年9—10月从吉林省和内蒙古自治区东部辣椒主产区采集的辣椒果实炭疽病样本进行病菌的组织分离和纯化，获得212株形态特征基本一致的菌株，对代表菌株进行柯氏验证，证明其具有致病性，为该病害的病原菌。结果表明，结合病原菌的形态学特征及基于ITS、TUB2、ACT、GAPDH和CHS-1基因序列构建系统发育树，确定病原菌为Colletotrichum nigrum。病原菌的生物学特性研究发现，OA培养基适合病原菌菌丝生长；D-麦芽糖是最佳碳源；蛋白胨为最佳氮源；最佳pH为10；最适培养温度为20 ℃；全黑暗时最适合菌丝生长。代表菌株对25种杀菌剂敏感性研究表明，400 g·L-1氯氟醚·吡唑酯SC、240 g·L-1氯氟醚·吡唑酯EC、42.4%唑醚·氟酰胺SC、40%唑醚·戊唑醇SC、43%唑醚·氟酰胺SC对病菌菌丝生长速率和孢子萌发均有明显抑制作用，其EC50＜1 mg·L-1，可作为该病害防治的优选药剂。

关键词：辣椒炭疽病；Colletotrichum nigrum；病原鉴定；生物学特性；药剂敏感性

中图分类号：S641.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）03-027-09

Identification， biological characteristics and fungicide susceptibility of Colletotrichum nigrum in pepper

CHEN Pengyu1， YANG Lihui1， ZHAI Changlan1， TIAN Huidi1， ZHANG Min1， BAI Qingrong1，2， ZHAO Tingchang3

（1.School of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jilin， China; 2.National Key Laboratory of Green Pesticide/Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering， Ministry of Education/Fine Chemical Research and Development Center of Guizhou University/Guizhou University，Guiyang， 550025， Guizhou， China; 3.Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： From September to October in 2021， 212 isolates with same morphological characteristics were obtained by tissue isolation method and purification from samples of diseased pepper fruit in Jilin and eastern Inner Mongolia. The pathogenicity of representative isolates were confirmed by inoculating health pepper fruits. Combined with the morphological characteristics of the pathogen and the phylogenetic tree constructed with ITS， TUB2， ACT， GAPDH and CHS-1 gene sequences， the pathogen was identified as Colletotrichum nigrum. Biological characteristics of the representative strain demonstraed that the optimum culture medium， pH， carbon source， temperature and light of mycelial growth were OA， D-maltose， peptone， pH 10， 20 °C， and total darkness respectively. The conidial germination and mycelial growth of pathogen to 25 fungicides showed that strain were the most sensitive to 400 g·L-1 mefentrifluconazole·pyraclostrobin SC， 240 g·L-1 mefentrifluconazole·pyraclostrobin EC， 42.4% pyraclostrobin·fluxapyroxad SC， 40% pyraclostrobin·tebuconazole， and 43% pyraclostrobin·fluxapyroxad SC with EC50<1 mg·L-1， they can be used as the preferred agents for disease control.

Key words： Pepper anthracnose; Colletotrichum nigrum; Pathogen identification; Biological characteristics; Fungicides susceptibility

辣椒炭疽病是由炭疽菌属（Colletotrichum spp.）真菌引起的一种常见病害，可导致幼苗死亡、叶片和果实腐烂，发病严重时，病果率在30%～40%[1]，严重影响辣椒的产量和品质。炭疽菌属（Colletotrichum）真菌是世界上重要的植物病原真菌群[2]，无性态为无性态真菌（Anamorphic fungi）炭疽属（Colletotrichum），有性态为子囊菌门（Ascomycota）小丛壳属（Glomerella）[3]。

在辣椒炭疽菌的早期分类中，根据病害症状分为红色炭疽病菌、黑色炭疽病菌和黑点炭疽病菌[4]。目前在我国天津、四川、贵州、广东、甘肃、陕西等地均有辣椒炭疽病的报道，引起辣椒炭疽病的病原菌主要包括C. acutatum（尖孢炭疽菌）、C. truncatum（平头炭疽菌）、C. spinaciae（菠菜炭疽菌）、C. boninense（博宁炭疽菌）、C. gloeosporioides（胶孢炭疽菌）、C. siamense（暹罗炭疽菌）、C. fructicola（果生炭疽菌）、C. scovillei（斯高维尔炭疽菌）、C. karstii（喀斯特炭疽菌）[5-11]。

2021年辣椒炭疽病在吉林省多地和内蒙古自治区东部地区的辣椒主产区大面积发生，对辣椒产业造成了十分严重的危害。笔者所在团队于2021年在吉林省洮南市、双辽市、长春市农安县、松原市长岭县和内蒙古自治区通辽市开鲁县的辣椒主产区进行辣椒炭疽病病样的采集，对病样进行分离纯化，明确病原菌分类地位，并对主要病原菌生物学特性及药剂敏感性进行研究，以期为辣椒炭疽病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2021年9—10月对吉林省及内蒙古自治区东部地区的辣椒主产区进行辣椒病样采集，记录发病特征并拍照，标本保存于吉林农业大学植物保护学院植物病理学教研室。分离物致病性测定供试菌株：在不同地区分离菌株中随机挑选1株，分别为HS4Y-2-19、DSD2Y-1-41、QTXB2Y-2-5-1、QJB1-2-36、HJ1Y-2-50、HLHY9-1-4-1。分子生物学测序供试菌株：在不同采样点分离菌株中随机选取以下菌株，分别为HS4Y-2-19、DSD2Y-1-41、MX6-1-45、QTN2Y-2-4-2、QTXB2Y-2-5-1、HLHY9-1-4-1、BPY1-3-49、HJY3-1-55、BPY3-2-60、QTN1Y-1-35、HJY1-2-50、QJB1-2-36。生物学特性及室内药剂敏感性供试菌株为HS4Y-2-19。选用25种化学杀菌剂作为供试药剂，药剂名称及生产厂家见表1。供试试剂有β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、无水乙醇、75%乙醇、琼脂糖、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）。

供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA）、燕麦琼脂培养基（Oatmeal Agar，OA）、水琼脂培养基（Water Agar，WA）、西红柿燕麦琼脂培养基（Tomato Oatmeal Agar，TOA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（Potato Sucrose Agar，PSA）、胡萝卜琼脂培养基（Carrot Agar，CA）、玉米粉琼脂培养基（Corn Meal Agar，CMA）、V8碳酸钙琼脂培养基（V8 Agar，V8）、查氏培养基（Czapek-Dox Agar，Czapek）。

供试仪器为光学显微镜（ZEISS ImagerA.2）、超景深显微镜（VHX-600）、GI80DWS高压蒸汽灭菌锅（上海言和）、SW-CJ-2D型双人净化工作台（浙江苏净净化）、BIC-300人工气候培养箱（上海博讯）、DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）、BCD-217CHG立式冷藏柜（河南新飞电器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 辣椒炭疽病病原菌的分离纯化 2021年9—11月，将采集到的辣椒炭疽病标本用无菌水清洗并消毒后，用灭菌剪刀剪取病健交界处的组织块5 mm×5 mm，组织块经体积分数为75%乙醇消毒，无菌水漂洗3次，在无菌操作台内将表面水分晾干后，放入事先准备好的PDA平板中，在恒温培养箱中25 ℃暗培养。待组织块在PDA平板上长出菌丝后，用灭菌牙签在菌落边缘挑取菌丝块放在新的PDA平板中，置于恒温培养箱25 ℃暗培养。

1.2.2 分离物的致病性测定 2021年11月，采用菌丝侵染和孢子侵染2种方式进行致病性测定。待分离物在PDA培养基上长至直径为培养皿2/3时，选取不同地区的代表菌株1株，用打孔器制备直径为6 mm的菌饼备用，另用无菌水将孢子洗脱制备成浓度为1.0×106个·mL-1孢子悬液备用。用无菌水将新鲜辣椒果实（辣帝1号，山东寿禾种业有限公司）表面冲洗干净后，使用75%乙醇对其进行表面消毒并使用无菌接种针制造细微伤口，分别将制备好的菌饼贴在细微伤口处；孢子悬浮液涂抹在细微伤口处，以无菌水作为对照，于25 ℃恒温培养箱中保湿培养，逐日观察发病情况。

1.2.3 病原菌形态特征观察 2021年11月，在PDA培养基上观察菌落生长状况。用光学显微镜（ZEISS ImagerA.2）观察分生孢子器和分生孢子的形态并拍照记录，用超景深显微镜（VHX-600）测量孢子大小（测量100个），初步确定病原菌的分类地位。

1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定 2021年11－12月，在吉林农业大学经济作物病害与生物防治研究室内进行病菌分子生物学鉴定。采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取不同地区的代表菌株基因组DNA（供试代表菌株信息见表2），选用ITS、ACT、TUB2、GAPDH和CHS-1进行PCR扩增，各基因扩增所需引物见表3。