西瓜蔓枯病菌的分离与鉴定及种质资源抗性评价

摘 要：为明确黑龙江省西瓜产区蔓枯病的病原真菌种类并筛选抗病种质资源，将采集的病样通过组织分离法和柯赫氏法则验证获得的16株真菌病原物提取DNA，使用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，用Blast对扩增产物纯化测序所得的序列进行比对，使用MEGA软件构建系统发育树以确定其属和种。对所有真菌菌株进行致病力测定，选取致病力最强的菌株XG2通过喷雾接种法评估31份西瓜种质资源的抗性。结果表明，分离物序列与亚隔孢壳菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum）的一致性为99.00%；31份种质材料中包含抗病材料5份（16.13%），中抗材料6份（19.35%），感病材料10份（32.26%），高感材料10份（32.26%）。综上所述，侵染黑龙江西瓜的蔓枯病真菌为S. cucurbitacearum，最抗病的材料是PI 189225，研究结果可为西瓜抗病育种提供材料和技术方法。

关键词：西瓜；蔓枯病；亚隔孢壳菌；种质资源；抗性评价

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）03-021-06

Identification of the fungal pathogen causing gummy stem blight and disease resistance evaluation of some germplasm resources

XU Chuzhen1， LIU Jinxin1， WANG Xiqing2， YAN Wen2， FU Yongkai2， LI Yonggang1

（1.College of Plant Protection， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， Heilongjiang， China; 2.Horticulture Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069， Heilongjiang， China）

Abstract： To clarify the pathogenic fungal species of gummy stem blight in the watermelon producing areas of Heilongjiang Province and to screen the disease-resistant germplasm resources， 16 pathogenic fungal DNA were extracted from the collected disease samples by tissue isolation and verification of Koch's postulates， amplified by PCR using fungal universal primers ITS1/ITS4， sequences obtained from purification and sequencing of amplification products were compared by Blast， a phylogenetic tree was constructed using MEGA software to identify the genera and species. All fungal isolates were assayed for their pathogenicity， and the most pathogenic isolate， XG2， was selected to evaluate the resistance of 31 watermelon germplasm resources by spray inoculation. The results showed that the sequence of the isolate was 99.00% consistent with Stagonosporopsis cucurbitacearum; a total of 31 germplasm materials， 5（16.13%）showed resistance to gummy stem blight， 6（19.35%）showed moderately resistance， 10（32.26%）were susceptible， and 10（32.26%）were highly susceptible. In conclusion， the gummy stem blight fungus infesting  watermelon in Heilongjiang is S. cucurbitacearum， the most resistant material was PI 189225， and this study provides materials and technical methods for watermelon resistance breeding.

Key words： Watermelon; Gummy stem blight; S. cucurbitacearum; Germplasm resource; Resistance evaluation

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.]是葫芦科西瓜属植物，也被称为夏瓜、寒瓜等，原产于非洲，自西域传入中国[1]。西瓜是世界上重要的园艺经济作物，而中国是世界上第一大西瓜生产国，占全球总产量的70%左右[2]。近年来，我国种植业不断发展，西瓜栽培面积日渐扩大，尤其是随着设施瓜类栽培技术的逐渐推广，导致许多瓜类病虫害的大范围流行，降低了西瓜的品质和产量[3]。西瓜蔓枯病（Gummy stem blight）是一种真菌性土传病害，发生范围广，且在整个生育期均可发病，可危害叶片、茎蔓和果实，其中茎蔓受害最为严重。据报道，西瓜蔓枯病发病率一般为15%～25%，严重时在60%～80%，病害流行时可使瓜田减产15%～30%，严重时可达80%，对西瓜的产量和品质以及我国的瓜类产业发展造成极大影响[4-6]。

国际上多认为蔓枯病菌有性态为Didymella bryoniae，无性态为Stagonosporopsis cucurbitacearum[7]，也有学者认为在大多蔓枯病菌寄主植物上可同时发现无性孢子与有性子实体，所以划分有性型和无性型意义不大[3]。2015年，Stewart等[7]明确，亚隔孢壳属病菌由S. cucurbitacearum、S. caricae和S. citrulli 3个亲缘关系相近的种组成，其中危害最广的病原菌为S. cucurbitacearum。如今国际使用Stagonosporopsis spp.作为蔓枯病菌的学术名称[8-9]。当病原菌侵染幼苗的茎部时，起初呈水渍状斑，迅速向上、下扩展，随后病斑可环绕茎部，迅速导致幼苗死亡。成株多于茎基部与节间发病，初期呈水浸状灰绿色病斑，形状多为棱形、椭圆及条形，后发展成黄白色凹陷病斑，病部龟裂，有时可见分泌形成的黄褐色胶状物。后期病斑表面散生黑色小颗粒，环境湿度高时，病部腐烂，维管束外露，呈现麻丝状[10-11]。

目前，瓜类蔓枯病的防治仍以化学防治为主，但该病害一般于中后期发病较重，西瓜是直接入口食物，化学杀菌剂的使用会对环境和人体健康造成较大危害，同时也极易导致病原菌产生抗药性。因此，选育抗病品种是防治瓜类蔓枯病最经济有效且安全的方法，而抗病种质资源的筛选与鉴定是抗病育种工作的基础。中国抗蔓枯病西瓜品种相对数量较少[3]。笔者对黑龙江省西瓜蔓枯病菌进行了分离与鉴定，并对31份西瓜种质材料接种蔓枯病以鉴定其抗性，以期筛选出较为优良的资源，为西瓜蔓枯病的抗病育种提供资源、技术方法及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试西瓜品种 供试31份西瓜种质资源以及致病性测定试验中所选用的西瓜品种龙盛佳星，其中，WG-12、WG-16和WG-31为中果型，其他种质为大果型，31份西瓜种质均由黑龙江省农业科学院园艺分院国家西甜瓜产业技术体系哈尔滨试验站提供。

1.1.2 供试病原菌 于2022年7－8月从黑龙江省农业科学院园艺分院试验地发病严重的地块采集症状典型的西瓜蔓枯病病样。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与鉴定 采用组织分离法[12]，于病健交界处切取组织块，依次用70%乙醇消毒30 s、1.5%次氯酸钠处理5 min，无菌水漂洗3次后置于无菌滤纸吸干水分。随后将组织块摆放于加入50 μg·mL-1链霉素的PDA培养基平板上，26 ℃培养2～3 d后挑取边缘菌丝进行纯化，使用纯化后的菌株进行单孢分离，将所获菌株转移至试管斜面培养，于4 ℃保存备用。通过观察菌落形态和孢子形态特征等方式对获得的单孢株进行初步鉴定。

为了进一步明确病原菌的种类，将所有单孢株于PDA平板上培养5 d，刮取适量病原菌菌丝，利用真菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工有限公司）提取DNA，采用通用引物细胞核核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed space，ITS）进行扩增，引物序列见表1。使用PCR扩增仪（GeneAmpPCRSystem9700）进行扩增，扩增体系（50 μL）为：2×Taq Master Mix 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物由上海生工有限公司进行纯化及测序，使用Blast对测序结果进行同源性比对，使用MEGA 7.0通过Neighbor-joining法构建ITS基因的系统发育树，校验参数设置为Bootstrap1000次重复[13]。

1.2.2 病原菌的致病性测定 遵循柯赫氏法则[14]进行致病性测定，参照Li等[15]的方法，将单孢株在25 ℃培养7 d，诱导S. cucurbitacearum产生分生孢子并将其刮到无菌水中，经3层灭菌纱布过滤，通过血球计数板将滤液稀释为1×106个孢子·mL-1的菌悬液，备用。

选取健康且生长一致的西瓜幼苗（3片真叶期），采用孢子悬浮液喷雾法接种幼苗至植株饱和状态，对照组用无菌水代替。接种后置于温室（23±3）℃用塑料布保湿培养，每个处理15株幼苗，3次重复，采用完全随机区组的试验设计。接种后观察发病情况，待植株发病充分且相对稳定后进行调查，参照张学军等[16]的病害分级标准，并稍作调整。分级如下：0级，无病斑；1级，零星的小病斑；3级，连续的小病斑或大病斑（没有绕茎）；5级，大病斑（绕茎）；7级，茎部失水萎缩但植株并未死亡；9级，茎部失水萎缩且全株死亡。

病情指数=Σ（各级病株数×各级代表值）/（调査总株数×最高级代表值）×100。

致病力评价指标：强致病力菌株（S），病情指数>60；中等致病力菌株（M），50<病情指数≤60；弱致病力菌株（W），病情指数≤50。

1.2.3 西瓜种质资源的蔓枯病抗性评价 选取31份西瓜育种资源，在温室内利用育苗钵（8 cm×8 cm×5 cm）培养至3片真叶期，选用1.2.2中致病力最强的菌株作为接种的目标病原菌，依据1.2.2的方法配制孢子悬浮液，采用喷雾接种法对31种不同的种质资源进行病原菌接种，对照组采用无菌水代替孢子悬浮液。接种后置于温室（23±3）℃用塑料布保湿培养，每个处理15株幼苗，3次重复，采用完全随机区组的试验设计。待植株充分发病且相对稳定后调查，病害分级标准同上。

以病情指数作为评价依据，将不同品种划分为6个抗性等级[17]，分别为：免疫（IM），DI=0；高抗（HR），0<DI≤20；抗病（R），20<DI≤40；中抗（MR），40<DI≤60；感病（S），60<DI≤80；高感（HS）：DI>80。