美洲南瓜Dof基因家族鉴定与表达模式分析

摘    要：DNA结合单锌指（DNA binding with one finger，Dof）是植物所特有的转录因子，主要参与调控植物的生长发育、抗逆和品质等生命活动过程。为了鉴定美洲南瓜Dof基因家族成员和探究其表达模式，从全基因组水平筛选和分析了美洲南瓜CpDof家族成员、基因结构、蛋白保守基序和亲缘关系等，同时，通过转录组和荧光定量技术比较了不同成员在美洲南瓜中的时空表达与果实发育表达特性。结果表明，在美洲南瓜中存在58个Dof基因并广泛分布于全基因组；功能域Motif 1存在于所有的Dof基因中；其启动子序列中含有光响应、激素响应和防御应激等顺式作用元件；Dof基因在美洲南瓜中具有组织表达特异性和时空表达特异性。基于转录组和荧光定量验证结果，表明CpDof7、CpDof30和CpDof42等基因与美洲南瓜356和296果实发育密切相关。以上结果为进一步克隆和解析南瓜属Dof基因功能提供了有力支撑。

关键词：美洲南瓜；DNA结合单锌指；基因家族；荧光定量PCR；果实发育

中图分类号：S642.6 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）05-016-13

Identification and expression pattern analysis of Dof gene family in  Cucurbita pepo

SUN Shouru HU Deju CHANG Jingyi WANG Yong MA Changsheng ZHU Lei

（1. Henan Cucumber Crop Planting Innovation and Utilization Engineering Technology Research Center， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Henan International Joint Laboratory of Horticultural Plant Biology/Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： DNA binding with one finger（Dof）is a transcription factor unique to plants， mainly involved in regulating plant life processes， such as growth and development， stress resistance， and quality. In order to identify the members of the Dof gene family and explore its expression pattern analysis in pumpkin （Cucurbita pepo）， this study screened and analyzed the members， gene structure， protein conservative motifs and genetic relationships of CpDof family from the whole genome， and compared the spatiotemporal expression and fruit development expression characteristics of different members through transcriptome and fluorescence quantitative techniques. The results showed that there were 58 Dof genes and widely distributed all over the different chromosomes; The functional domain Motif 1 exists in all Dof genes; The promoter sequence contains cis acting elements such as light response， hormone response， and defense against stress; Dof gene has tissue expression specificity and spatiotemporal expression specificity in Cucurbita pepo. Based on the results of transcriptome and fluorescence quantitative verification， CpDof7， CpDof30 and CpDof42 genes are closely related to the fruit development of pumpkin 356 and 296. This provides strong support for further cloning and analysis of the Dof gene function in Cucurbita species.

Key words： Cucurbita pepo; DNA binding with one finger; Gene family; Fluorescence quantitative PCR; Fruit development

美洲南瓜（Cucurbita pepo）是葫芦科南瓜属重要栽培种之一，原产于北美洲南部，并广泛分布于世界各地[1]。美洲南瓜于19世纪中叶由欧洲引入中国，并在南北方广泛栽培[2]。近些年来，随着中国设施栽培的迅速发展，美洲南瓜的种植面积逐渐扩大，目前是仅次于黄瓜的早春茬瓜类蔬菜[3]。美洲南瓜种植技术简单，适合集约化栽培与管理，且易获得高产，因此，研究和利用美洲南瓜可以为我国园艺产业的多样性和种业发展提供保障。

DNA结合单锌指（DNA binding with one finger，Dof）家族是植物所特有的转录因子家族之一，其DNA富含一个独特的单锌指结构域，所以它也被称为Dof基因家族[4]。Dof蛋白的两个主要功能性结构域是N端的DNA结合域和C端的转录调控域[5]，N端是由52个高度保守的氨基酸残基组成C2-C2型单锌指结构域，并且该结构中还有4个保守的Cys残基和1个Zn2+共价结合[6]。C端的转录调控域氨基酸序列多变，保守性较低，进而导致了Dof蛋白的功能具有多样性。研究发现，如果锌指结构中的Cys残基或Zn2+离子发生改变，均会导致Dof蛋白丧失活性[7]。

Dof转录因子在植物生长发育、产量和抗性等方面均具有调控作用，是重要的明星转录因子之一。1993年，玉米的ZmDof1基因是第一个被鉴定到的Dof家族成员，它的主要功能是参与调控C4植物的光合作用[8]。目前Dof基因家族已经在拟南芥[9]、大豆[10]、白菜[11]、番茄[12]和黄瓜[13]等多个物种中被鉴定出来。Dof蛋白的功能具有多样性，主要涉及到植物的种子萌发、开花调控、非生物胁迫和生长发育等。如在拟南芥中，鉴定出来CDF1（Cycling Dof Factor1）和CDF2等多个Dof基因通过抑制CO（CONSTANS）基因表达来调控开花期[14-17]；在拟南芥突变体dag1（Dof Affecting Germingation1）的种子中，发现和赤霉素合成相关的基因表达量显著上调，进一步推测该基因通过抑制赤霉素的生物合成来调控种子的萌发[18]。Dof家族成员还参与了植物对多种非生物胁迫的响应，拟南芥的AtDof5.8基因与ANAC069启动子的AAAG序列特异结合，响应高盐、干旱和ABA胁迫[19]；在拟南芥中，过表达番茄的SlCDF1或SlCDF3基因，都可以提高植株的耐干旱性和耐盐胁迫性[20]。Dof蛋白也参与了植物的多种生长发育过程，过表达的OsDof12水稻株系在长日照条件下开花期显著提前[21-22]，并且过表达OsDof12转基因株系不仅减少水稻主支和侧支的数目，降低植株高度，还使水稻的叶片变短、小穗长度变小，说明OsDof12参与水稻株型的建成[23]。并且有研究表明，水稻的OsDof3基因能够影响种子糊粉层中赤霉素响应的相关基因来参与调控种子萌发[24]，OsDof24和OsDof25则能够调节水稻种子中贮藏蛋白谷蛋白GluB-1基因的表达[25]。在大豆中，过表达GmDof11显著增加了转基因植株的分枝数、主茎节数和百粒质量，并提高了种子含油量及大豆的产量[26-27]。以上研究结果为筛选和鉴定美洲南瓜Dof基因家族及其相关研究提供了重要思路。

美洲南瓜是重要的瓜类蔬菜作物之一，在世界各地广泛栽培，深受消费者喜爱，在瓜果蔬菜生产中也占有重要的地位。Dof基因家族在植物生长发育的各个方面和对逆境的响应过程中都有参与。然而，目前在美洲南瓜中还未有任何与Dof基因相关的研究与报道。因此，笔者以美洲南瓜为研究材料，从全基因组水平鉴定和筛选了美洲南瓜Dof基因家族成员，还分析了其在染色体上的位置、蛋白理化性质、基因结构、保守基序和进化关系等信息，同时利用转录组数据重点筛选了果实发育相关基因，并利用实时荧光定量技术进行了验证，为进一步研究美洲南瓜Dof基因家族的功能提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 美洲南瓜Dof基因家族成员的筛选与鉴定

从葫芦科基因组数据库（http：//www.cucurbitgenomics.org/organism/14）中根据Dof基因家族的功能域，初步筛选获得了美洲南瓜的全部Dof候选基因，同时利用拟南芥的Dof成员进行了基因组数据库的同源比对分析和筛选。然后，利用在线网站NCBI的CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）对候选Dof蛋白序列的保守结构域进行验证，将下载的文件放在软件Tbtools中进行可视化处理，剔除重复冗余及不含Dof结构域的不完整序列，最终获得美洲南瓜Dof基因家族的全部候选基因，并根据其在染色体上的位置依次命名。通过Tbtools软件中的Show Genes on Chromosome和Advanced Circos插件对Dof基因进行染色体位置和共线性的可视化分析与绘图。

1.2 基因的结构和保守基序分析及系统进化树的构建

依据美洲南瓜Dof基因家族成员的mRNA全长序列、CDS序列、氨基酸序列、外显子数量等基本数据，利用软件Tbtools中的“Protein Paramter Calc”插件分析该基因家族蛋白的理论等电点、分子质量、不稳定系数和疏水性等理化性质；利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析基因家族成员的保守基序，其中参数设置如下：保守基序数量为15个，motif的长度为6～50 aa，最后将motif分析后的数据进行可视化处理[28]。

将葫芦科作物美洲南瓜、西瓜、甜瓜和黄瓜（http：//www.cucurbitgenomics.org/）中的Dof蛋白质序列进行同源比对分析，并利用软件MEGA7中的最大似然法（maximum likehood，ML）构建葫芦科Dof蛋白的系统进化树，最后利用iTOL（https：//itol.embl.de/）对构建的进化树进行美化与调整。

1.3 启动子顺式作用元件分析

从美洲南瓜基因组数据库中截取Dof基因家族每个成员的启动子序列（ATG上游2000 bp的序列），导入文本并整理成FAST文件，将该文件提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站进行启动子顺式作用元件分析。根据分析结果，对其进行筛选排序，并利用Tbtools中的“Simple Bio Sequence Viewer”模块进行可视化处理与分析。