利用西瓜愈伤组织快速检测CRISPR/Cas9基因编辑效率

摘    要：西瓜作为重要的园艺经济作物，其CRISPR/Cas9基因编辑效率的快速检测方法仍十分匮乏。以愈伤组织再生能力强的野生西瓜种质ZTC为试验材料，针对西瓜ClPDS基因构建CRISPR/Cas9双靶点敲除载体，利用农杆菌侵染西瓜幼嫩子叶，在含1.0 mg·L^-1 2，4-二氯苯氧乙酸生长素的MS培养基中诱导愈伤组织形成，通过绿色荧光蛋白标记筛选阳性愈伤组织，检测其编辑效率。结果表明，2个靶点均发生基因编辑，靶点1处的编辑效率为42.95%，靶点2处的编辑效率为29.92%。在愈伤组织中建立了西瓜生长发育早期有效基因编辑效率检测体系，为后续编辑株系的确定节约了大量时间，为基因编辑技术应用于西瓜重要农艺性状改良及优异种质创制提供了技术支撑。

关键词：西瓜；CRISPR/Cas9；愈伤组织；编辑效率检测

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）05-029-08

Rapid CRISPR/Cas9 efficiency testing by transient transformation in watermelon callus

PENG Ting， LIU Man， LIU Chunyu， WANG Jiafa， TIAN Shujuan， YUAN Li

（State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： The simple and effective system to test CRISPR/Cas9 gene editing efficiency has not been established in watermelon，  an important horticultural cash crop. In this study， the wild watermelon germplasm ZTC with strong callus regeneration ability was used as the material， and the CRISPR/Cas9 dual-target knockout vector was constructed to target the watermelon ClPDS gene. The watermelon young cotyledons were infested with Agrobacterium strain EHA105， then these incubated explants were cultivated in callus induction media. The positive callus was screened by green fluorescent protein label， and the editing efficiency of target sites were further tested by deep sequencing respectively. The results showed that the target 1 and target 2 had been mutated， and the total editing efficiency of target 1 and target 2 were 42.95% and 29.92%， respectively. Thus， a simple and rapid testing system of gene editing efficiency was established in watermelon callus during the early development stage， which saves time and labor for the subsequent experiment， and also provided a basic technical support for future watermelon CRISPR/Cas9 gene editing technology application.

Key words： Watermelon; CRISPR/Cas9; Callus; Editing efficiency testing

基因编辑技术是目前分子育种3.0时代的核心技术，是进行作物性状改良及新种质创制的关键技术。其中，CRISPR/Cas9基因编辑系统因设计简单、操作方便等诸多优点成为当下应用最为广泛的基因编辑工具之一，在植物生长发育、果实品质、响应生物与非生物胁迫研究方面发挥重要作用[1]。该工具主要是通过sgRNA和Cas9蛋白完成对基因组DNA双链的识别和切割，在细胞内实现基因定点修饰，激发细胞自身的修复机制，DNA在修复的过程中造成核苷酸序列改变从而实现基因编辑[2-3]。随着对CRISPR/Cas9系统研究的不断深入，发现该系统在工作过程中存在编辑效率低或无法正常编辑的情况，导致在转基因阳性植株筛选过程中无法获得正确编辑的突变体或突变体多为嵌合体等一些缺点[4-5]。因此，寻找早期快速、准确地检测编辑效率的方法已成为降低研究者工作量、提高工作效率、精准鉴定后期突变体表型的迫切需求。

植物中早期快速检测基因编辑效率的研究报道较少。张月乔等[6]利用西瓜不定根测定CRISPR/Cas9载体中所选靶点的可行性；杨孟霞等[7]通过发根农杆菌转化番茄子叶产生毛状根，提取转基因毛状根基因组DNA检测CRISPR/Cas9多靶点载体的编辑效率。通常情况一条不定根是由一个细胞发育形成的，导致检测编辑效率时需要采取大量根部样品，以保证编辑效率的准确性。在水稻[8]、玉米[9]和拟南芥[10]中可以利用其原生质体细胞检测CRISPR/Cas9系统的编辑效率，该方法主要利用PEG将构建的基因敲除载体转化原生质细胞，通过显微镜统计转基因细胞的比例，然后提取转化后原生质体的DNA检测编辑效率。原生质体检测编辑效率时样品由无数单一细胞构成，满足检测样品数量多的条件，但该方法涉及原生质细胞的提取、转化以及培养等繁琐过程，导致试验可控性和稳定性较差。当CRISPR/Cas9系统应用于梨树研究时，由于梨组培苗的再生率低，杨锋等[11]在梨愈伤组织中建立高效的基因编辑体系并检测该系统的编辑效率。愈伤组织细胞检测方式是采用农杆菌介导的遗传转化方法侵染植物外植体，在特定条件下诱导愈伤组织细胞团的形成，挑取转基因愈伤组织细胞检测基因编辑效率。因此，利用愈伤组织早期快速检测编辑效率的方法克服了不定根检测法效率检测准确率低的问题，同时克服了原生质体法可控性差、稳定性差的缺点，是目前较理想的编辑效率检测方法。

西瓜（Citrullus lanatus）为葫芦科西瓜属的一年生蔓生植物，因其清爽解渴，营养价值丰富，是夏季防暑降温必备水果，是我国重要的经济园艺作物之一[12-13]。2017年，许勇团队将CRISPR/Cas9技术成功地应用于西瓜物种中，定向敲除西瓜白化基因，同时利用西瓜原生质检测该系统的编辑效率[14]。然而，利用愈伤组织快速准确检测基因编辑效率在西瓜中的应用待进一步研究。针对西瓜稳定遗传转化周期长、培养过程复杂和西瓜原生质体细胞不易提取和培养等问题[15-16]，笔者以愈伤再生能力强的野生型西瓜种质ZTC为材料，采用农杆菌介导的遗传转化方法侵染幼嫩子叶外植体并诱导愈伤组织形成，通过西瓜愈伤组织细胞检测CRISPR/Cas9基因编辑效率，在西瓜中建立一种简单快速的CRISPR/Cas9基因编辑效率的检测方法，为其他葫芦科作物及植物编辑效率快速检测提供技术基础，具有重要的理论意义和实践价值。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型种质ZTC，生长于关中平原与黄土高原过渡区域。由于ZTC可进行高效稳定的遗传转化以及该种质的愈伤再生能力强，因此选择野生型西瓜种质ZTC为材料展开研究。试验材料于2021年3－8月种植于西北农林科技大学园艺学院杨凌西甜瓜示范基地的塑料大棚，2021年10月收取种子用于后续试验。由西北农林科技大学西甜瓜课题组提供CRISPR/Cas9基因编辑载体pBSE402和pCBC-DT1T2[17-18]。大肠杆菌（E. coli）DH5ɑ菌株和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105购于上海唯地生物技术有限公司

1.2 CRISPR/Cas9双靶点敲除载体的构建

（1）用限制性内切酶BsaI 酶切pBSE402载体，得到线性化载体。反应体系为：2 µg pBSE402质粒，5.0 µL 10×CutSmart Buffer，1.5 µL BsaI-HF，补充dd H₂O至50 µL的反应体系，37 ℃酶切45 min。

（2）使用文献报道的西瓜PDS基因ClPDS（Cla010898）的2个靶点作为编辑效率检测靶点[14]，以ClPDS-F/R为引物，pCBC-DT1T2载体为模板，使用高保真酶进行PCR扩增，该PCR产物的5’和3’最末端的序列分别与pBSE402线性化载体两末端序列完全一致。

（3）使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒回收纯化上述获得的线性化载体和PCR产物后，通过同源重组方法进行连接，取10 μL连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，检测阳性克隆，测序正确后提取大肠杆菌质粒，获得正确的重组质粒pBSE402-PDS。

（4）吸取2 μL pBSE402-PDS重组质粒加入100 μL的农杆菌EHA105感受态细胞，冰上5 min，液氮5 min，37 ℃ 5 min，冰上5 min后加入500 μL LB液体培养基，200 r‧min-1 28 ℃ 3 h后，5000 r‧min^-1离心5 min，倒上清液400 μL，将剩余100 μL液体与底部菌液吸打混匀，涂布在50 mg·L^-1卡那霉素和20 mg·L^-1利福平LB固体培养基上，28 ºC培养2～3 d。挑取PCR验证后的单菌落至10 mL 50 mg·L^-1卡那霉素和20 mg·L^-1利福平的LB液体培养基中，在200 r‧min^-1 28 ℃的摇床上摇至OD600=0.8。

1.3 西瓜愈伤组织编辑效率统计方法

1.3.1 西瓜愈伤组织遗传转化方法 西瓜愈伤组织的遗传转化主要是参照西瓜遗传转化过程和愈伤诱导培养条件[19-20]，具体步骤如下：

（1）外植体制备：准备20粒ZTC种子，55 ºC 温汤浸种30 min，剥去种壳；在超净台中将种子在75%乙醇浸泡30 s，灭菌水清洗3遍，3%次氯酸钠浸泡15 min，然后用灭菌水清洗5～6遍，灭菌滤纸上晾干；平放到播种培养基（琼脂Agar powder 6.4 g·L-1），于28 ºC黑暗条件下生长2～3 d；待下胚轴长至5 mm左右时，在超净台中将每粒种子2片子叶分别切成4块，即为制备好的外植体。

（2）外植体侵染：在20 mL无菌注射器中加入10 mL MS液（M519 4.43 g·L^-1+蔗糖30 g·L-1+6-BA 1.5 mg·L^-1+40.0 mg·L-1乙酰丁香酮），取1 mL OD₆₀₀=0.8的菌液加入MS液体中制成侵染液；将制备好的外植体浸泡在侵染液中，抽真空15 min；弃侵染液，取出外植体平铺在灭菌滤纸上晾干。

（3）愈伤的组织培养：将晾干外植体移至含有1.0 mg·L^-1 2，4-D的MS固体培养基（M519 4.43 g·L^-1+蔗糖30.00 g·L^-1 + 琼脂G3251 3.00 g·L^-1+200 mg·L^-1 TMT）并调pH值为6.0以诱导愈伤组织。

1.3.2 西瓜愈伤组织编辑效率检测方法 使用体视荧光显微镜挑取发荧光的愈伤细胞，取20个独立愈伤组织细胞团混合成为1个样品，共计3个重复。采用CTAB法提取发荧光愈伤组织DNA，设计引物PDS-F1/R1、PDS-F2/R2扩增含靶点的ClPDS基因序列送Sanger测序，设计引物PDSd-F1/R1、PDSd-F2/R2扩增包含靶点的ClPDS基因序列送深度测序（Hi-TOM），检测靶点编辑效率以及编辑类型[21]（表1）。