明日叶茎基腐病病原菌鉴定及生物学特性研究

摘    要：为了明确明日叶（Angelica keiskei）茎基腐病致病菌及其生物学特性，采用组织分离法对明日叶茎基腐病样进行病原菌分离纯化，通过柯赫氏法则进行致病性验证，通过形态观察结合rDNA-ITS序列比对进行病原鉴定，对致病菌的最佳碳氮源等生物学特性进行测定，并在室内检测11种商品药剂对病原菌的抑制效果。结果表明，明日叶茎基腐病致病菌为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum），该病原菌最适生长温度为25 ℃；供试范围中所有pH范围均可生长，最适pH值为5；供试碳氮源中对葡萄糖、蔗糖和D-果糖的利用率最高，菌落直径最大，达到6.22 cm，最佳氮源为酵母提取物，菌落直径达到7.27 cm。在室内药效测定试验的11种药剂中，50%异菌脲对菌株MF1的抑菌效果最佳，菌丝生长抑制率达到88.89%。综上所述，首次确定了引起明日叶茎基腐烂的病原菌为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum），通过调节土壤酸碱度可能有利于减轻病害，50%异菌脲可作为田间化学防治的备选药剂。

关键词：明日叶；核盘菌；生物学特性；杀菌剂筛选

中图分类号：S567.23+9 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）05-044-07

Identification and biological characteristics of basal stem rot pathogen on Angelica keiskei

ZHOU Jie WEN Shengqiao QI Chuandong YANG Shuo XIAO Ying WU Jinping GUO Fengling

（1. Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement， Wuhan 430064， Hubei， China; 3. Wuhan Customs District P.R.China， Wuhan 430040， Hubei， China; 4. Xianning Academy of Agricultural Sciences， Xianning 437100， Hubei， China）

Abstract： To identify the pathogen of basal stem rot on Angelica keiskei and clarify the biological characteristics， the pathogenic fungus were isolated by tissue isolation method， pathogenicity test was complied to Koch’s rule. The pathogen was identified by the morphology and analysis of rDNA-ITS sequence. The biological characteristics of the pathogen were determined， and the inhibitory effects of 11 kinds of fungicides on the pathogen was screened. The results showed that Sclerotinia sclerotiorum was the pathogen of Ashitaba stem rot， the optimal temperature of the pathogen growth was 25 ℃， the optimal pH value in the test range was 5. Among the tested carbon and nitrogen sources， the utilization rate of glucose， sucrose and D-fructose was the highest， and the maximum colony diameter was 6.22 cm; the best nitrogen source was yeast extract， the colony diameter was 7.27 cm. The result of toxicity tests of 11 fungicides against MF1 showed the antifungal effect of 50% iprodione was the best， the inhibition rate of mycelium growth was 88.89%. In conclusion， S. sclerotiorum was identified for the first time as the pathogen of basal stem rot on Angelica keiskei in this study. The disease may be effectively alleviated by adjusting the pH of the soil. 50% iprodione can be used as an alternative agent for chemical control of this disease in the field.

Key words： Ashitaba; Sclerotinia sclerotiorum; Biological characteristics; Fungicide screening

明日叶（Angelica keiskei）属于伞形科当归属，是一种多年生草本植物，原产于日本，因当地居民常食之而寿命长，故有“长寿草”之称[1]。作为药食同源植物，其嫩茎叶不仅可鲜食，还可用于茶叶、酒品等营养功能性食品及食品工业方面[2-3]，极具开发前景。目前，明日叶已在我国海南、云南、广东、山东、四川等地引进种植，667 m2产值可达上万元，有望成为回报率高、产值高的新兴高效农业项目[4]。随着明日叶产业的发展，其种植规模日益扩大，种植过程中病害的发生对该产业的健康发展将造成一定影响。

作为一项新兴产业，国内外对于明日叶的研究多集中在栽培措施、营养品质、功能成分和药用价值等方面。罗玉兰等[5]比较了设施大棚、露地大田和盆栽种植明日叶的生长情况及品质，结果表明，采用设施大棚种植明日叶效果最好，可在实现明日叶周年供应的同时提高其产量与品质。王亚楠等[6]通过对明日叶不同部位营养成分分析发现，其叶相较于茎更具有营养价值和利用价值。Aulifa等[7]发现，明日叶叶片提取物具有抗氧化剂和酪氨酸酶抑制剂的功效；Yoshioka等[8]研究发现，明日叶具有防治肌肉萎缩的功效。随着明日叶功能开发和产业发展，明日叶病害的相关研究近年来才逐渐受到重视。Sakamoto等[9]从日本种植的明日叶斑驳叶片中分离到一种花叶病毒，经鉴定发现，该病毒为马铃薯Y病毒属中的一种新病毒。Wu等[10]、周洁等[11]发现，由链格孢引起的叶斑病可导致明日叶减产近40%，研究了叶斑病病原菌生物学特性，同时进行了室内药效测定[10-11]。

植物茎基腐病的致病菌病原种类相对较多，其中镰刀菌占多数。小麦茎基腐病病原菌为镰刀菌，其中假禾谷镰刀菌的致病力最强，但不同来源和不同菌株的假禾谷镰刀菌之间致病力也存在差异[12]。百香果茎基腐病病原菌为腐皮镰刀菌，甲苯醚菌酯对其防治效果较好[13]。张艳婷[14]发现，6种不同的病原菌均能引起草莓茎基腐病，其中暹罗炭疽菌、尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌的致病力最强。漆永红等[15]研究发现，尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌均能侵染党参导致茎基腐病的发生，其中尖孢镰刀菌致病性最强，为优势种，苯醚甲环唑对3种镰刀菌均有很强的抑制活性。此外，镰刀菌在鸢尾[16]、蓝莓[17]、马铃薯[18]等多种作物上均可侵染导致茎基腐病的发生。前人研究报道其他病原菌也可导致植物茎基腐的发生，王飞等[19]发现丹参茎基腐病病原菌为链格孢属细极链格孢，而西葫芦茎基腐病致病菌则是露湿拟漆斑菌[20]。

随着明日叶功能成分研究的日益完善，其应用前景日趋广阔，种植规模也逐渐扩大，但明日叶病害相关研究较少，关于明日叶茎基腐病病原菌的研究尚未报道，其致病菌尚不明确。因此，笔者结合病原菌形态和rDNA-ITS序列分析，对明日叶茎基腐病病原菌进行鉴定，同时进行病原菌生物学特征测定和室内药剂筛选，以期为明日叶茎基腐病的防治提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

明日叶茎基腐病病样于2021年5月采自湖北省农业科学院经济作物研究所蔬菜试验示范基地。供试马铃薯琼脂培养基（PDA）配方如下：马铃薯200.00 g、葡萄糖20.00 g、琼脂16.00 g，用蒸馏水配制至1 L；供试查氏培养基配方如下：硝酸钠 2.00 g、磷酸氢二钾1.00 g、氯化钾0.50 g、七水合硫酸镁0.50 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30.00 g、琼脂16.00 g，用蒸馏水配制至1 L[21]。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 病样在流水下充分冲洗干净，吸干表面水分。采用组织分离法[22]，选择田间发病植株茎基部的病健交界处切20个5 mm×5 mm大小的组织块，用75%乙醇进行表面消毒10～20 s，无菌水漂洗3次后用3%次氯酸钠溶液消毒30 s，无菌水漂洗3次后放置于PDA平板25 ℃培养，待组织块周围有菌丝长出时及时挑取菌丝尖端至新PDA平板上，如此纯化3次。选择具有代表性的菌株接种于PDA平板上，25 ℃恒温培养备用。

1.2.2 病原菌致病性鉴定 选取健康的明日叶植株，分别切取其茎基部和根部组织块用75%乙醇进行表面消毒，在接种处用无菌接种针扎小孔3个，用接种针挑取菌丝接种于小孔处，放置25 ℃恒温培养箱培养，定期观察组织块的发病情况。以无菌水为对照，每个处理3次重复。待组织块发病后进行组织分离，并对分离的病原菌进行鉴定。

1.2.3 病原菌分子鉴定 采用CTAB法提取分离得到的病原菌基因组DNA，利用通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对病原菌的rDNA-ITS序列进行扩增[23]。所得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，送武汉天一辉远生物科技有限公司进行纯化和序列测定，测序结果在NCBI中进行Blast比对分析，利用Mega 6.0采用邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树进行病原菌鉴定。参考菌株序列来源于NCBI数据库。

1.2.4 病原菌生物学特性 （1）温度对病原菌菌丝生长的影响：用5 mm直径的打孔器打取菌饼接种于PDA平板中心处，分别放置在20、25、30、35 ℃的恒温培养箱中培养，36 h后采用十字交叉法测量菌落直径大小，每皿测定直径数2个，每个处理设置3次重复。

（2）pH值对病原菌菌丝生长的影响：PDA培养基pH值分别调至5、6、7、8、9、10、11等7个梯度，用5 mm直径的打孔器打取菌饼接种于相应的PDA平板中心处，25 ℃恒温培养，2 d后采用十字交叉法测量菌落直径大小，每皿测定直径数2个，每个处理设置3次重复。