寿光设施番茄死棵病原真菌的分离及鉴定

摘    要：为了明确寿光地区番茄死棵病害发生分布情况及其真菌病原菌种类，采用随机调查的方法对寿光地区 8 个设施番茄产区进行病害调查，并从死棵病株中分离纯化菌株，通过形态学、分子生物学和人工接种等方法对病原菌进行了鉴定。结果表明，寿光大部分设施番茄产区均有死棵病害发生，平均发病率为 13.3%。共分离获得真菌菌株 249 株，鉴定出 2 种镰刀菌，分别为尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌，其中尖孢镰刀菌的分离频率较高，属于优势菌属，又进一步鉴定为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型、番茄枯萎病生理小种1 和生理小种3。针对不同的病原菌，可以制定有效的策略，进行针对性的病害防控，为设施番茄安全生产及抗病育种提供重要依据。

关键词：番茄死棵；尖孢镰刀菌；病原菌鉴定；优势菌种

中图分类号：S641.2+S626.5         文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）09-07-09

Isolation and identification of pathogenic fungi from dead tomato plants in Shouguang facilities

CHENG Lin1， LI Shanshan2， WU Yufen1， LI Yanqing3， ZHANG Haijuan4， WEI Meitian5

（1. Shandong Shouguang Vegetable Seed Industry Group Co.Ltd.， Shouguang 262700， Shandong， China; 2. China Agricultural University， Beijing 100083， China; 3. Weifang University of Science & Technology， Shouguang 262700， Shandong， China; 4. Zibo Digital Agriculture Rural Development Center， Zibo 255020， Shandong， China; 5. Shandong Shouguang Vegetable Industry Group Co.Ltd.， Shouguang 262700， Shandong， China）

Abstract： In order to clarify the occurrence and distribution of tomato plant dead diseases in Shouguang area and the fungal pathogens， the random method was used to investigate the diseases in 8 facility tomato production fields in Shouguang area， and the strains were isolated and purified from the tomato plant dead . The pathogens were identified by morphology， molecular biology and artificial inoculation. The results showed that tomato plant dead occurred in most of the tomato production areas in Shouguang， with an average incidence rate of 13.3%. A total of 249 fungal strains were isolated and two species of Fusarium were identified， named F. oxysporum and Fusarium solium. Among them， F. oxysporum has a higher isolation frequency and belongs to the dominant genus. F. oxysporum was further identified as F. oxysporum tomato neck rot root rot specialization type， tomato fusarium wilt physiological race 1 and physiological race 3. To sum up， the fungal pathogens that cause tomato plants dead in Shouguang area are F. solanum， F. oxysporum tomato neck rot root rot specialization， Fusarium wilt physiological race 1 and physiological race 3， and there are pathogenic bacteria compound infection. According to different pathogenic bacteria， effective strategies can be formulated to carry out targeted disease prevention and control， which provides important basis for safe production and disease resistance breeding of tomato in facilities.

Key words： Dead tomato plant; F. oxysporum; Pathogen identification; Dominant strain

我国是世界上番茄种植面积最大、产量最高的国家[1]。山东省是我国番茄种植的主产区之一，寿光蔬菜种植面积近4万hm2，其中设施番茄的栽培面积占寿光设施栽培面积的30%左右。近年来，随着农业种植结构调整、商业品种推广单一、田间管理不当以及气候条件的影响，番茄死棵现象的发生及危害逐年加重，成为制约番茄产业发展的重要因素之一[2-3]。

在引起番茄死棵的病害因素中，枯萎病和番茄颈腐根腐病是主要真菌病害。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型 FOL（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）侵染所引起的土传病害。尖孢镰刀菌的不同菌株对不同品种的番茄存在致病能力的差异，因此相关研究人员又将番茄枯萎病菌分为不同的生理小种，即生理小种 1、2、3[4-8]。番茄颈腐根腐病（ Fusarium crown and root rot， FCRR） 是由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型 FORL（ Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici ） 引起的一种与番茄枯萎病症状极为相似的真菌土传病害。张斌等[9]对江苏省分离获得的茄病镰刀菌进行回接试验，32个茄病镰刀菌菌株均能引起番茄植株产生根部腐烂、萎蔫等症状。周黎等[10]研究认为引起新疆地区番茄根腐病的病原菌除了尖孢镰刀菌，还有茄病镰刀菌和串珠镰刀菌。程琳[11]、李景富等[12]对山东番茄死棵病害进行研究，经鉴定认为致病菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型。张秀等[13]对山东省6个地区的病原菌鉴定，发现寿光地区为番茄枯萎病生理小种3。

尖孢镰刀菌分布广、寄主多、侵染能力强，不同地区引起死棵病害的病原菌种类存在一定的差异，在实际的栽培过程中发病症状很难区分，因此加大了该病害的防治难度。为此，笔者的试验拟通过对寿光地区设施番茄死棵病害进行调查，了解目前寿光地区设施番茄死棵病害的发病情况。同时分离番茄死棵真菌病害的病原物，结合形态学观察、分子生物学鉴定和人工接种等方法确定病原菌种类，为今后寿光地区番茄死棵病害防治工作及番茄抗病育种提供一定的参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2021年5—12月在山东省寿光市寇家坞、田柳镇、稻田镇、古城番茄小镇、野虎村、王家尧、化龙镇、蔬菜小镇等8个地方进行，在种植番茄的温室大棚中选取发生死棵病害的番茄植株96 株，包括大粉果系列、大红果系列、草莓番茄系列和樱桃番茄系列各24株。

致病性测定所用的番茄为山东寿光蔬菜种业集团提供的黄金明珠，为黄色大果番茄，产自西安市航丰种业有限公司，对番茄枯萎病和番茄颈腐根腐病均为高感。

1.2 方法

1.2.1 番茄死棵病害的发生情况调查 对8个种植番茄的产区进行病害随机调查。调查方法为随机取样法，在每个地区随机选取 3 个温室大棚进行田间调查，每个温室大棚内采取平行线取样法，随机选取 5～6 垄进行番茄死棵病害的调查，并进行病害发生率的统计。同时观察病株的病症并拍照及采集。发病率/% = 发病株数/调查总株数×100。

1.2.2 病原菌的分离纯化 采用组织分离法，用灭菌的剪刀剪取大小为0.5～1.0 cm2根部及根茎部的病健交界处组织，用75%酒精消毒后，放入PDA培养基中，然后放入27 ℃恒温培养箱中培养。3～4 d后观察其生长情况，并用单孢分离法进行纯化。

1.2.3 病原菌的鉴定 采用形态学观察、分子生物学鉴定及致病性测定3种方法对分离到的病原菌进行鉴定。

（1）形态学观察：依据 Booth 分类系统[14]同时参考《常见镰刀菌鉴定指南》[15]，观察菌落的大小、形状、颜色，以及分生孢子形态、大小等特征，对分离到的菌株进行形态学鉴定。

（2）分子生物学鉴定：采用真菌DNA快速提取试剂盒提取病原菌DNA，提取物于 -20 ℃保存。利用真菌rDNA 转录间隔区通用引物 ITS1/ITS4[16] 进行PCR扩增，产物采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。后将未纯化的PCR产物送到华大基因青岛分公司进行正向测序，分离所得的菌株的rDNA-ITS序列运用GenBank中的数据库中Nucleotide BLAST进行同源性比对分析，结合病原菌形态特征，判断所分离菌株的种类，确定分类地位。参考Hirano和Arie[17]的方法，用3对特异性引物sp13f/r、sp23f/r、sprlf/r进行尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型及枯萎病生理小种的鉴定。PCR反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）致病性测定：根据Koch氏法则进行分离物的回接测定。每种致病菌中选取8个有代表性的菌株，用打孔器在分离纯化培养后的菌落边缘取直径1 cm 菌饼3片，放入装有 150 mL PDB培养基的三角瓶中，在150 r·min-1、27 °C下摇2～3 d后用4层纱布过滤，用血球计数板进行计数，用无菌水配制成孢子浓度为1×107 CFU·mL-1的孢子悬浮液。

采用浸根法接种。待番茄长到2～3叶1心时，将番茄苗连根拔起，用自来水冲去根部土粒，然后用无菌的小刀将主根根基部切一个小伤口，在已配好的孢子悬浮液中浸泡15 min后，转移到装有无菌土的营养钵中定植，放入温度为25～30 °C的温室中培养。每个菌株3个重复，每个重复10个处理，以清水作为对照，15 d后统计其发病情况。病情指数=Σ（病级株数×各病级数值）/（总株数×最高级别）。病情指数分级标准见表1。

1.3 数据处理

采用 DPS（9.01）进行数据处理和完全随机设计单因素试验方差分析。