植物组培抗菌剂PPM对萝卜种子消毒及无菌苗生长的影响

摘    要：为了建立萝卜组培过程中种子消毒及培养的简单有效方法，以萝卜种子为试材，采用L16（43）正交设计，开展了植物组培抗菌剂PPM浸泡浓度（1.0%、1.5%、2.0%和3.0%）、浸泡时间（0.0、0.5、2.0和4.0 h）及培养基中PPM浓度（0.0、0.1%、0.3%和0.6%）对萝卜种子消毒效果及无菌苗生长的研究。结果表明，PPM浸泡浓度对污染率有显著影响，对发芽率、根长、株高和下胚轴长的影响不显著；PPM浸泡时间对发芽率、污染率、根长、株高和下胚轴长均有显著影响；培养基中PPM浓度对污染率、根长、株高和下胚轴长具有显著影响，对发芽率无显著影响。主次效应分析表明，培养基中PPM浓度是影响污染率、根长、株高和下胚轴长的最主要因素，PPM浸泡时间影响次之，PPM浸泡浓度影响最小，最优组合A2B3C2可使发芽率达到96.67%，污染率为2.22%，根长为7.00 cm，株高为8.60 cm，下胚轴长为0.73 cm。探索开发了一套操作简便、无需冲洗的萝卜种子消毒方法以及高发芽率、低污染率的无菌苗培养方法。

关键词：萝卜；种子消毒；植物组培抗菌剂；无菌苗

中图分类号：S631.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）09-116-07

Effects of plant preservative mixture （PPM） on seed disinfection and aseptic seedling growth of radish

SUN Yaling1， LIU Chen1， LIU Xianxian1， NIU Yunhua2， HE Qiwei1， HUO Yumeng1， XU Wenling1

（1. Shandong Key Laboratory of Greenhouse Vegetable Biology/Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center/Vegetable Science Observation and Experimental Station in Huang-Huai District of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Vegetable Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， Shandong， China; 2. Laizhou Agricultural Comprehensive Development Service Center， Laizhou 261400， Shandong， China）

Abstract： In order to establish a simple and efficient method for seed disinfection and aseptic seedling culture in radish tissue culture， L16 （43） orthogonal design， which including soaking concentration（1.0%、1.5%、2.0% and 3.0%）， soaking time（0.0、0.5、2.0 and 4.0 h） and PPM （plant preservative mixture） concentration（0.0、0.1%、0.3% and 0.6%） in the culture medium， was used to study the disinfection effect of PPM on radish seeds and the growth of steriled seedlings. The results showed that the soaking concentration of PPM exhibited a significant effect on the contamination rate， but was not significant on the germination rate， root length， plant height and hypocotyl length; the soaking time of PPM had significant effect on germination rate， contamination rate， root length， plant height and hypocotyl length; the concentration of PPM added in the medium had a significant effect on the contamination rate， root length， plant height and hypocotyl length， but was not significant on the germination rate. The analysis of primary and secondary effects showed that the PPM concentration in culture medium was the most important factor affecting the contamination rate， root length， plant height and hypocotyl length， followed by the soaking time of PPM， and the soaking concentration of PPM was the smallest. The optimal combination A2B3C2 achieved a germination rate of 96.67%， a contamination rate of only 2.22%， a root length of 7.00 cm， a plant height of 8.60 cm， and a hypocotyl lenth of 0.73 cm. In summary， a set of simple and efficent methods with high germination rate and low contamination rate for radish seed disinfection and aseptic seedling culture are explored and developed.

Key words： Radish; Seed sterilization; Plant preservative mixture; Aseptic seedling

萝卜（Raphanus sativus L.）为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，是我国重要的根菜类蔬菜作物，因其具有较高的营养价值和医疗价值，在世界各地广泛种植[1-2]。近年来，国内学者相继开展了萝卜重要性状的分子生物学研究，显著提升了我国萝卜遗传育种水平。萝卜是典型的再生顽拗型植物，遗传转化十分困难，关于萝卜遗传转化体系和基因功能实质性验证的研究鲜见报道[1，3-4]。遗传转化体系的建立离不开组织培养，相对于其他十字花科蔬菜，由于萝卜小孢子培养诱导率较低，目前萝卜组织培养所用的外植体主要来源于种子发芽后生长4 d左右的无菌苗[5-6]。然而萝卜种子种皮较薄，在脱粒、晾晒过程中易受伤，且种荚收获后雨水较多，晒种过程中易受潮发霉进而使种子内部受到微生物（内生菌或其他有害微生物）污染，普通的表面消毒方法无法彻底消除污染，从而导致组培过程中污染严重，影响后续试验。

在以往的研究报道中，萝卜种子采用的常规消毒剂多为酒精、次氯酸钠和氯化汞[7-13]。次氯酸钠和HgCl2消毒后均需无菌水反复冲洗3～4遍，否则残留的消毒剂影响无菌苗的正常生长，其步骤繁琐，且对种子内部微生物的消毒效果不佳。因此，建立简单、高效的无菌苗培养体系是萝卜遗传转化体系中的重要环节。

植物组培抗菌剂PPM（plant preservative mixture）是一种广谱抗微生物制剂，能有效抑制植物组织培养中的微生物污染，且在一定浓度和时间内不会影响种子发芽、愈伤组织增殖和再生。同时，它具有极高的热稳定性，能与培养基一起高压灭菌，无需反复冲洗，极大地避免了二次污染，应用领域及前景非常广泛[14-21]。目前采用PPM抗菌剂对种子消毒的研究鲜见报道[22]，更未见该抗菌剂用于萝卜种子消毒的报道。为此，笔者开展了PPM用于萝卜种子消毒及无菌苗生长的研究，采用正交试验优化筛选获得了PPM浸泡浓度、浸泡时间及培养基PPM浓度的最佳组合，以期在此环节为萝卜遗传转化及开放式组培体系的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2022年6—9月在山东省农业科学院蔬菜研究所进行。所用萝卜编号为2022-198，由玉娘红（武汉莱福健农业科技有限公司）选育获得，该品系早熟、耐热、红皮、白肉。植物组培抗菌剂PPM购于北京酷来搏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 以PPM浸泡浓度（A）、浸泡时间（B）、培养基PPM浓度（C）为因素，每个因素4个水平，按L16（43）正交表（表1）进行正交试验设计。共16个处理（处理1为对照组，即浸泡时间为0 h，且培养基未添加PPM），每个处理30粒种子，3次重复，播于90 mm培养皿上。

无菌苗的获得：选取颗粒饱满的萝卜种子，按照表1的正交设计，将种子分别浸泡0、0.5、2、4 h后，直接播于1/2 MS培养基（含20 g·L-1蔗糖+10 g·L-1琼脂粉，pH 5.8）上，培养基按表1处理添加不同浓度的PPM。于温度为25 ℃、光照时间为16 h·d-1、光照度为2000 lx条件下培养，获得无菌苗。

1.2.2 测定指标及方法 播种5 d后，统计发芽种子数、污染种子数，并用直尺（精度为1 mm）测量根长、株高和下胚轴长度，计算发芽率和污染率。

发芽率/%=发芽种子数/播种种子数×100；

污染率/%=污染种子数/播种种子数×100；

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2016进行统计，以SPSS 19.0进行差异显著性分析，并采用极差分析各因素的主次效应及优选组合。

2 结果与分析

2.1 PPM对萝卜种子消毒效果和无菌苗生长的影响

图1和表2为萝卜种子16个不同处理的发芽及无菌苗生长情况。在所有处理中，处理7的污染率最低，为0，且显著低于处理1、6、10、11和16，其中处理6、11和16仅进行了PPM浸种处理，无菌苗生长的培养基中均未添加PPM，污染率在30.00%以上，但与培养基中未添加PPM的处理1（污染率65.56%）相比，污染率显著降低。而处理5、9和13均未进行浸种消毒，仅在培养基中添加了PPM，污染率在2.00%～4.00%。浸种与培养基中同时使用PPM的处理2、3、4、7、8、10、12、14、15，其污染率在0～6.67%。由以上结果可知，萝卜种子单独采用PPM浸种处理，其污染率最高可达51.11%，无法满足组培的需求，而在培养基中同时使用PPM，处理7、4和12可以使污染率降低至小于2.00%。从发芽率来看，未使用PPM的处理1最高，为100.00%，且处理1、2、3、5、6、7、8、9、13、14、15之间差异不显著，发芽率均高于95.55%，处理1发芽率仅显著高于4、10、11、12、16处理。上述低污染率且高发芽率的PPM处理组合2、3、5、7、8、9、13、14、15均可用于萝卜种子消毒培养且不影响种子的萌发。

萝卜幼苗的生长发育根据根长、株高、下胚轴长3个指标进行统计分析，其对照均为处理1。由表2可知，处理2、5、6、8、11、12、15的根长均显著长于对照，处理2的根最长，为8.00 cm；处理6、11、12、15的株高显著高于对照，处理6的株高最高，为8.80 cm。处理2、5、7、8、11、12、15、16的下胚轴长均显著长于对照，处理2下胚轴最长，为0.83 cm。以上结果表明，处理11、12、15的根长、株高和下胚轴长均显著高于对照。

因此，萝卜种子在适宜浓度的PPM溶液中浸泡后，直接播种于含合适浓度的PPM培养基中萌发生长，可获得高发芽率、低污染率，且生长指标最优的无菌苗。综合发芽率、污染率、根长、株高和下胚轴长，从处理11、12、15中初步筛选出发芽率最高的处理15，即3.0% PPM浸泡2 h后播种于PPM浓度为0.1%的1/2 MS培养基中，作为萝卜种子消毒及无菌苗培养的初筛最优组合（表2）。