西瓜花叶病毒西葫芦分离物的基因组及其侵染性克隆

摘    要：西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus，WMV）是危害瓜类作物的一种主要病毒，笔者分析了西葫芦分离物CH99/69的基因组序列和分子变异，构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。结果显示，CH99/69分离物基因组全长为10 047 nt，与其他分离物的全基因组核苷酸、多聚蛋白核苷酸和多聚蛋白氨基酸的序列一致性分别为81.40%～94.80%、81.40%～94.70%、88.40%～97.20%。基于全基因组序列的系统进化分析显示，CH99/69与中国的Urumqi火参果分离物、WMV-WS西葫芦分离物和法国的WMV-Fr西葫芦分离物亲缘关系较近，它们均聚于Ⅰ组中，而与中国的WMV-Pg人参分离物、WMV-GZca臭椿分离物、hollyhock蜀葵分离物亲缘关系最远。接种试验显示，CH99/69分离物的克隆具有侵染性，能系统侵染甜瓜、西瓜、西葫芦和瓠瓜，经接种产生的病毒后代能够通过摩擦接种进行侵染。

关键词：西瓜花叶病毒；西葫芦分离物；基因组；侵染性克隆

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）10-016-07

The genome and infectious clone of watermelon mosaic virus zucchini isolate

LIU Liming1，2， PENG Bin1， KANG Baoshan1，2， WU Huijie1，2， LIU Qian1，2， GU Qinsheng1，2

（1. Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology/Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China）

Abstract： Watermelon mosaic virus （WMV） is one of the most important viruses in cucurbits crops. In this study， the genome sequence of isolate CH99/69 was cloned and analyzed， and its full-length cDNA clone was constructed. The results showed that the genome of isolate CH99/69 was 10 047 nt in length， and the identities of the genome nucleotide sequence， the polyprotein nucleotide and amino acid sequence between CH99/69 and other isolates were 81.40%-94.80%， 81.40%-94.70% and 88.40%-97.20%. Phylogenetic analysis based on genome sequences showed that CH99/69 was most closely related to isolate Urumqi and WMV-WS from China and WMV-Fr from France， those of which clustered in group Ⅰ， but isolates WMV-Pg， WMV-GZca and hollyhock from China were the farthest related. The inoculation showed that the infectious clone was successfully constructed， and it could systematically infect melon， watermelon， zucchini， and bottle gourd. The progeny produced from the clone was infectious by mechanical inoculation.

Key words： Watermelon mosaic virus; Zucchini isolate; Genome; Infectious clone

西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus，WMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），主要分布在温带和地中海地区，自然条件下通过蚜虫以非持久性方式进行传播，也可通过机械方式进行传播。该病毒寄主范围广泛，可侵染西瓜、甜瓜等多种葫芦科作物，也可侵染胡萝卜[1]、刺槐[2]、芝麻[3]、甜椒[4]、兰花[5]、百香果[5]、人参[6]、臭椿[7]、紫薇[8]、蜀葵[9]等作物，主要引起植株矮化、叶片花叶和畸形，影响作物的商品性。

WMV是一种单链正义RNA病毒，基因组全长约为10 kb，编码一个多聚蛋白，该蛋白可被自身编码的蛋白酶识别，切割成10个成熟蛋白P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP，在P3编码区由转录滑动机制产生第11个蛋白P3N-PIPO[10]。基于P1、NIb-CP和CP的N端核苷酸序列，WMV分成经典组（CL）、组2（G2）和新兴组（EM）。CL组包含法国流行的经典分离物，EM组包含法国东南部新发生的在西葫芦上引起严重症状的分离物，G2组分离物无特殊生物学性状，来自世界不同地区[11-12]。研究显示，该病毒基因组不同区域的分子变异性有所差异，且基因组内存在大量的重组断裂点[4，13-17]，进行系统进化分析时有必要获得病毒的全基因组序列。

病毒侵染性克隆的获得使得研究RNA病毒实现了在DNA水平上进行各种分子操作，近年来，病毒侵染性克隆应用越来越广泛[18-21]。前期中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组（本团队）从西葫芦发病植株上分离得到WMV分离物CH99/69[22]，在此基础上，笔者拟通过扩增获得该分离物的全基因组序列，并进行全基因组序列分析，同时通过构建它的全长cDNA克隆，分析其在不同瓜类作物上的侵染性，为在瓜类作物上开展该病毒的致病和抗病相关的工作奠定基础。考虑到目前已有WMV其他分离物侵染性克隆成功构建的报道[23-25]，该克隆的获得也将有助于开展不同分离物之间分子变异性、致病性和适应性的联合分析，以更好地揭示WMV分子进化机制，为控制该病毒导致的病害探索新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2021年4—9月在中国农业科学院郑州果树研究所进行。供试WMV分离物CH99/69来源于西葫芦发病植株，由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组鉴定和保存。植物表达载体pXT1由南京农业大学陶小荣教授馈赠。

1.2 方法

1.2.1 载体构建 取约0.1 g西葫芦发病叶片，利用RNAsimple总RNA提取试剂盒和PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser提取叶片总RNA和合成cDNA，具体操作参照试剂盒说明书。从GenBank数据库中下载并比对分析WMV的全基因组序列，根据序列的保守性，设计5对引物HF-W-1F/W-1R、W-2F/W-2R、W-3F/W-3R、W-4F/W-4R、W-5F/HF-W-5R（表1），以合成的cDNA为模板，将分离物CH99/69的全基因组分成5段进行扩增，随后利用NEBuilder高保真DNA组装预混液将扩增获得的5个PCR产物与经Stu I和Sma I双酶切处理的植物表达载体pXT1进行同源重组、转化、菌液PCR筛选、测序验证，最终获得含有CH99/69全基因组的cDNA克隆pWMV-CH99。

1.2.2 序列分析 对pWMV-CH99进行测序、拼接，获得CH99/69分离物的全基因组序列。从GenBank数据库中下载38条来自不同国家的WMV分离物全基因组序列，利用ClustalW软件将它们与CH99/69分离物进行序列比对，再用BioEdit软件对它们进行全基因组核苷酸和氨基酸序列一致性分析[26]。以大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，SMV，NC_002634）为外组，基于以上WMV分离物的全基因组核苷酸序列，利用Mega X软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）进行系统进化分析[27]，1000次重复。

1.2.3 接种试验 试验于2021年6—8月在中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组温室进行。其中，甜瓜品种为白玫，由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供；西瓜品种为红和平，种子购自浙江浙农种业有限公司；西葫芦品种为珍玉358，种子购自河南豫艺种业科技发展有限公司；瓠瓜品种为亲抗水瓜，种子购自湖南雪峰种业有限公司。将pWMV-CH99转入农杆菌菌株GV3101中，随后进行培养、接种，将pWMV-CH99转入农杆菌菌株GV3101中，随后进行培养、接种，将pWMV-CH99利用农杆菌介导的方法接种甜瓜、西瓜、西葫芦和瓠瓜植株，并将发病叶片进行摩擦接种分析，具体方法参照刘莉铭等[28]的报道。采集系统发病叶片，以W-8674F/W-10047R为引物（扩增的目的片段为1374 bp），利用HiScript® II One Step RT-PCR Kit （Dye Plus）对病毒的侵染情况进行检测分析。另外，以W-9399F/W-T7-9782R为引物，对CH99/69基因组9399～9782 nt区域进行扩增，经体外转录合成地高辛标记的RNA探针，利用dot blot方法检测植株叶片中WMV的侵染情况。

2 结果与分析

2.1 WMV分离物CH99/69基因组结构分析

CH99/69分离物基因组全长为10 047 nt，它的5′UTR和3′UTR分别对应基因组的1～132 nt和9796～10 047 nt，全基因组编码1个由3220个氨基酸组成的多聚蛋白（133～9795 nt），经蛋白酶切割，形成10个成熟的蛋白质，同时P3编码区内部通过+2移码产生PIPO，它可与P3的N端融合表达形成P3N-PIPO蛋白，其基因组结构如图1所示，GenBank登录号为MN296125。

2.2 分离物CH99/69序列分析

序列一致性分析结果（表2）显示，不同WMV分离物之间的全基因组核苷酸、多聚蛋白核苷酸和多聚蛋白氨基酸序列一致性分别为81.10%～99.70%、81.10%～99.80%、87.20%～99.80%，分离物CH99/69与这些分离物的序列一致性分别为81.40%～94.80%、81.40%～94.70%、88.40%～97.20%。其中，CH99/69与中国乌鲁木齐的火参果分离物Urumqi（MW345911）的序列一致性最高，分别为94.80%、94.70%、97.20%，与中国陕西的西葫芦分离物WMV-WS （KX664483）一致性次之，与中国辽宁的臭椿分离物WMV-GZca（MF418043）一致性最低。

基于WMV全基因组序列的系统进化分析结果显示，供试39个WMV分离物可以分为4组，本研究获得的CH99/69分离物与来自中国乌鲁木齐的火参果分离物Urumqi（MW345911）、中国陕西的西葫芦分离物WMV-WS（KX664483）和法国的西葫芦分离物WMV-Fr（AY437609）亲缘关系较近，它们均聚于Ⅰ组中，而与中国的人参分离物WMV-Pg（KX926428）、臭椿分离物WMV-GZca（MF418043）、蜀葵分离物hollyhock（MK217416）亲缘关系最远（图2）。