黄瓜β-酮脂酰辅酶A合成酶基因CsKCS11的功能初步分析

摘 要：为了鉴定和挖掘黄瓜β-酮脂酰辅酶A合成酶（β-Ketoacyl CoA synthetase，KCS）编码基因，以设施黄瓜为材料，通过转录组测序鉴定、基因克隆与表达载体的构建、干旱胁迫下的表达分析和转化拟南芥等方法，研究了CsKCS11的生物学功能。结果表明，黄瓜CsKCS11基因（NCBI登录号OL660537）的开放阅读框为1542 bp，编码513个氨基酸；序列分析表明，CsKCS11蛋白亲疏水性平均值（Gravy）为-0.083，为亲水性蛋白，二级结构中α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角所占比例分别为44.64%、35.48%、15.20%和4.68%；系统进化分析表明，CsKCS11与冬瓜KCS11蛋白亲缘关系最近；同时将CsKCS11转化拟南芥，转基因拟南芥后代植株具有抵御干旱胁迫的能力；干旱胁迫下的表达分析表明，黄瓜CsKCS11能够被干旱胁迫诱导表达，且随着干旱胁迫时间的延长，其表达量呈现出先升高后降低的趋势，并且在干旱胁迫12 h时达到最高。研究结果为进一步阐明黄瓜CsKCS11参与蜡质合成的机制奠定了基础。

关键词：黄瓜；表皮蜡质；KCS；抗旱

中图分类号：S642.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）10-023-09

Preliminary functional analysis of β-ketoacyl-CoA synthase CsKCS11 gene from Cucumis sativus L.

WEI Mingyue1， GUO Xiaowen1， QIU Jiaxin1， SONG Yiying1， CHAI Guaiqiang1， 2， DUAN Yizhong1， 2

（1. College of Life Science， Yulin University， Yulin 719000， Shaanxi， China; 2. Shaanxi Key Laboratory of Ecological Restoration in Shaanbei Mining Area， Yulin 719000， Shaanxi， China.）

Abstract： To identify and excavate the genes encoding β-Ketoacyl CoA synthetase （KCS） in cucumber （Cucumis sativus L.）， the greenhouse cucumber was used as the material， and the biological function of CsKCS11 was studied by transcriptome sequencing， gene cloning， expression vector construction， expression pattern analysis under drought stress and genetic transformation in Arabidopsis thaliana. The results showed that the open reading frame of CsKCS11 gene （accession number OL660537）was 1542 bp， encoding 513 amino acids. Sequence analysis showed that the average value of hydrophobicity （Gravy） for CsKCS11 was -0.083 and it was a hydrophilic protein with proportions of α helix， random curl， extended chain and β folding of 44.64%， 35.48%， 15.20% and 4.68%， respectively. Phylogenetic analysis showed that CsKCS11 had a high sequence similarity with KCS of other species， and was closely related to BhKCS11 from white gourd. At the same time， CsKCS11 was linked to pCSXN vector， the plant overexpression vector was successfully constructed， and it was transformed into A. thaliana. The transgenic Arabidopsis had the ability of drought resistance under drought stress. The expression analysis showed that cucumber CsKCS11 could be induced to express by drought stress， and with the prolongation of drought stress， the expression level of CsKCS11 increased at first and then decreased， and reached the peak at 12 h of drought stress. This study provides a basis for further elucidating the mechanism of cucumber CsKCS11 involved in cuticular wax biosynthesis.

Key words： Cucumber; Cuticular wax; β-ketoacyl CoA synthetase（KCS）; Drought resistance

植物表皮是植物体与其所处的环境直接接触的部位，包括角质层和蜡质层[1-2]。其中，植物表皮蜡质是覆盖在陆生植物表面的一层透明晶状体，是一种不溶于水的有机混合物，其主要成分由烷烃、脂肪酸、醛、初级醇、次级醇、酯类等组成。研究表明，植物表皮蜡质具有调节植物非气孔性水分散失、抵御病虫害等功能[3-4]，因此，在植物抵抗生物、非生物胁迫中发挥着越来越重要的作用。不同植物表皮蜡质的化学成分不同，使得植物表皮蜡质晶体结构存在一定的多样性[5]。Barthlott等[6]借助电镜对10 000多种植物的表皮进行了扫描分析，将植物表皮蜡质晶体归纳为片状、板片状、柱状、条状、管状、颗粒状、光滑状等。拟南芥茎秆蜡质晶体为柱状[7]，小麦、水稻苗期叶片蜡质形态以片状为主[8-9]，番茄叶片蜡质呈现出光滑状[10]；即使同一种植物的不同器官，其蜡质晶体也存在差异，如小麦旗叶正面和反面的蜡纸晶体分别呈现出片状和密集的管状[11]。

对拟南芥表皮蜡质合成途径的研究表明，拟南芥蜡质合成主要分为在质体内的从头合成、在内质网上超长链脂肪酸的合成以及在内质网中的蜡质合成[12]。其中，超长链脂肪酸的合成是在头合成形成16碳和18碳的脂酰CoA的基础上，再经过碳链的延长形成各种碳链长度的脂酰CoA，此过程需要碳链延长酶（fatty acid elongase）的催化；而控制脂肪酸碳链延长的酶是一个包括多种酶的复合体，至少需要4种酶参与脂肪酸碳链延长反应，共同完成超长链脂肪酸的合成[13]。其中，β-酮脂酰辅酶A合成酶（KCS）是脂肪酸碳链延长酶复合体催化反应中第一步反应的酶，也是整个超长链脂肪酸延长合成中的限速酶，因此，鉴定并研究KCS的功能对植物表皮蜡质合成与调控机制的解析具有重要意义[14-15]。

KCS主要存在于植物体中，其种类和数量在不同物种间存在较大差异。模式植物拟南芥和水稻中分别有21个和34个KCS基因[16-17]。目前对KCS基因家族的研究主要集中在拟南芥上，如FAE1是首个从拟南芥中克隆出的KCS基因，该基因主要在种子中表达，催化C20和C22脂肪酸的生物合成[18]；CER6/CUT1参与链长大于24个碳以上的脂肪酸合成，并促进茎和花粉的表皮蜡质积累[19]。此外，在其他植物如甘蓝型油菜、小麦、水稻和紫花苜蓿中都已经克隆了KCS相关基因[20]。

黄瓜为主要的蔬菜作物，其叶片以及果实表皮具有较厚的蜡质，但当前对于黄瓜表皮蜡质合成相关研究的报道还较少。王世峰[21]研究了CsCER10在黄瓜中的表达模式，并利用RNAi技术解析了其在蜡质合成中的功能。王文娇[22]从黄瓜中分离克隆了CsCER1和CsWAX2，并利用转基因等方法，阐明了黄瓜中CsCER1和CsWAX2基因表达量异常影响了黄瓜表皮蜡质中的烷烃含量。此后，黄瓜蜡质合成相关基因CsCER4、CsCER7也相继被克隆出来[23-24]。Zhang等[25]在黄瓜中鉴定了1个AP2/ERF型转录因子CsWIN1，研究表明，CsWIN1通过调控CsCER1、CsCER1-1、CsCER4等的表达促进蜡质的积累。最近，Zhai等[26]通过图位克隆首次明确了调控黄瓜果实亮度的关键基因D，该基因编码一种C2H2类型锌指蛋白转录因子，并通过一系列生理试验及转录组分析发现，D基因通过调控黄瓜果实表皮角质层的发育来影响果实亮度。此外，Yang等[27]也通过图位克隆的方法获得了调控黄瓜亮度的主效基因CsZFP6，发现该基因能通过与CsMAH1、CsCER1等共表达，参与黄瓜果皮蜡质的合成。

笔者的研究拟通过分析黄瓜转录数据库，鉴定黄瓜β-酮脂酰辅酶A合成酶KCS，克隆黄瓜CsKCS11基因，并利用生物信息学分析、转基因功能验证和干旱胁迫下的表达分析等方法解析CsKCS11的生物功能，以期为黄瓜遗传育种和品种改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄瓜品种全兴优冠F1是抗病耐高温材料，由山东宁阳金兴种业有限公司培育，种植在榆林市榆林学院西区种植园区玻璃日光温室，生育期内水肥管理同温室其他植物。待黄瓜幼苗生长6～8周时，取黄瓜幼嫩叶片样品，置于液氮中保存备用。黄瓜表皮蜡质合成基因CsKCS11转化载体pCXSN-CsKCS11由榆林学院植物资源化利用及生态修复课题组构建，详见图1。试验于2020年7月至2022年3月在榆林学院植物分子遗传育种实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 黄瓜叶片总RNA的提取和cDNA的合成 从温室中取黄瓜叶片用无菌锡箔纸包裹住叶片置于液氮中，在液氮超低温环境中保存，提取RNA时，在研钵中加入液氮，将黄瓜叶片研磨至粉末状，利用多糖多酚RNA试剂盒（全式金）提取RNA，提取过程严格按照说明书进行。RNA的完整性通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测。同时使用反转录试剂盒完成cDNA第一链的合成，并于-20℃保存。

1.2.2 黄瓜CsKCS11基因的克隆 根据实验室前期构建的黄瓜叶片和果实转录组数据库，通过植物蜡质合成通路及注释分析，从中发现了在黄瓜叶片及果皮中表达量均较高的一条KCS序列，并依据开放阅读框，设计特异引物F1：CATCGCAATGGGAAATGACGGAG和R1：GATCTTGGCACCCCAAATTAGAGA。以稀释15倍的cDNA为模板，扩增CsKCS11基因，扩增体系为50 μL：2×Pfu Mix buffer 25 μL，dNTP 4 μL，引物F、R各2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 16.5 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 60 s；95 ℃ 50 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 5 min。产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳后回收目标基因片段。将目标基因片段末端加A后，连接到EZ-T载体，并转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素（100 mg·L-1）的LB固体培养基上筛选出阳性克隆，通过菌落PCR鉴定阳性克隆[28]。最后挑选出至少3个阳性克隆，送至上海生物工程有限公司测序，筛选出正确的CsKCS11基因序列。