甜瓜高效不定芽再生体系的建立

摘    要：对8个基因型甜瓜再生能力进行研究，筛选出再生能力较强的基因型，并以其为材料对外植体类型，不定芽诱导、伸长和不定根诱导3个阶段植物生长调节剂的类型与质量浓度进行优化筛选，旨在建立甜瓜高效的不定芽再生体系。结果表明，不同基因型间再生能力存在差异，2个厚皮甜瓜基因型B8、P110和1个薄皮甜瓜基因型IVF05再生能力较强，其中B8再生效果最好；以B8材料为基础建立再生体系，发现不定芽诱导能力最高的外植体为子叶近胚轴端，不定芽诱导阶段最适的培养基为MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 ABA，不定芽诱导率96.7%；不定芽伸长和不定根诱导最适的培养基分别为MS+0.1 mg·L-1 6-BA和1/2 MS+0.5 mg·L-1 IBA，获得的再生苗生根率达93.3%。

关键词：甜瓜；再生体系；基因型；外植体；植物生长调节剂

中图分类号：S652 文献标识码：A 文章编号：1673-2871（2023）11-010-06

Establishment of an efficient regeneration and genetic transformation system in melon

HE Yuhua1， 2， XU Longlan1， TANG Lingli1， 2， XU Yongyang1， 2， TIAN Xiaoqin1， ZHANG Jian1， 2， KONG Weihu1， 2， LI Wendong3， ZHAO Guangwei1， 2

（1. Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. National Nanfan Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Sanya 572000， Hainan， China; 3. Weifang Chuangke Seeds Co.， Ltd.， Changle 262400， Shandong， China）

Abstract： Gene functional verification was limited because of lacking of the efficient genetic transformation in melon （Cucumis melo L.）. Improving the regeneration rate to build an efficient adventitious bud regeneration system， which is the base to realize the genetic transformation of melon. Therefore， we studied the adventitious bud induction ability of eight melon genotypes， screened out the optimum melon genotypes for regeneration. And then the optimal research on the types of explants， types and concentrations of plant growth regulators during adventitious bud induction and elongation， and adventitious root induction was conducted. The results showed that there was a difference in regeneration ability among eight diverse genotypes. The two accessions B8， P110 from Cucumis melo L. ssp. melo and one accession IVF05 from Cucumis melo L. ssp. agrestis possess stronger regeneration ability， especially the B8 accession. Based on the B8 accession， we studied the primary elements influenced the regeneration system. The results showed that the type of explants with the highest ability to induce adventitious buds was the cotyledons near hypocotyl; the most suitable medium composition for the induction stage of adventitious buds is MS medium with 6-Benzylaminopurine （1.0 mg·L-1） and abscisic acid （1.0 mg·L-1 ）; the most suitable medium composition for adventitious bud elongation and adventitious root induction were MS medium with 6-BA （0.1 mg·L-1） and 1/2 MS medium with 3-Indole-3-butyric acid （0.5 mg·L-1） respectively. Finally， we screened out a genotype （B8） with stronger regeneration ability， and successfully established an efficient adventitious bud regeneration system based on the genotype， the rooting rates of adventitious roots is 93.3%.

Key words： Melon; Regeneration system; Genotype; Explant; Plant growth regulator

甜瓜（Cucumis melo L.）属于葫芦科甜瓜属，是世界上重要的园艺经济作物之一。我国是世界甜瓜生产和消费第一大国，据联合国粮食与农业组织（FAO）统计数据，2021年我国甜瓜种植面积为38.66万hm2，产量达1400万t，占世界总产量的49%。当前甜瓜育种多依赖杂交、回交等传统育种手段，存在育种周期长、盲目性大、改良数量性状效果较差等缺点[1-2]。与传统育种相比，分子育种更精准高效，是当前和未来甜瓜育种中的重要策略。解析基因功能是开展分子育种的前提，遗传转化是进行基因功能验证、明确基因功能最直接的手段，而构建甜瓜高效不定芽再生体系是实现遗传转化的基础。

甜瓜不定芽再生体系受基因型、外植体类型、植物生长调节剂的种类与浓度等因素的影响。不同基因型甜瓜的内源激素水平存在差异，因而其再生能力也有所不同[3-4]。研究表明，不同基因型甜瓜间再生率差异显著，且薄皮甜瓜再生率要高于厚皮甜瓜[5-10]。选择不定芽诱导能力较高的外植体类型，是建立再生体系的关键。而不同类型的外植体，其细胞结构和种类存在一定差异，未分化的分生组织及分化程度较低的薄壁组织细胞更适于诱导再生[11-12]。前人研究发现，甜瓜的各个部位均可用于组织再生获得完整植株，其中子叶、下胚轴使用较多[5，13-17]。另外，植物生长调节剂的种类和浓度是影响外植体分化的重要因素，常用于甜瓜再生的植物生长调节剂有6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。在不定芽诱导阶段，一般均需添加6-BA，添加质量浓度一般在0.5～2.0 mg·L-1，添加少量的IAA或ABA能够更好地平衡内源激素水平，提高不定芽再生率[17-20]。不添加植物生长调节剂也可以实现不定芽的伸长和生根，再生率约为70%[21-22]，而添加少量的植物生长调节剂能够促进不定芽伸长和生根，并且缩短再生时间。添加低质量浓度的6-BA（0.05～0.5 mg·L-1）能够促进不定芽伸长且降低玻璃化程度，再生苗状态较好，再生率为80%左右[3，18-19，23-24]。以1/2 MS培养基为基础，添加少量IAA或IBA（0.2～0.5 mg·L-1最佳），能够促进不定芽生根[16-20，25-26]。

尽管甜瓜再生体系构建已有不少报道，但在甜瓜离体再生过程中仍存在愈伤组织分化出芽困难、不定芽诱导率低和再生体系重复性差等问题。笔者以8个甜瓜基因型为试验材料，通过对甜瓜基因型，外植体类型，不定芽诱导、伸长及不定根诱导过程中植物生长调节剂种类和质量浓度等关键影响因素进行探究，以期筛选出再生能力强、不定芽再生率高的甜瓜基因型并建立重复性高的甜瓜不定芽再生体系，为甜瓜遗传转化体系的建立提供一定科学依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料及地点

试验材料共8份不同的甜瓜种质，包括3个厚皮甜瓜材料：B8（红心脆，原新疆地方品种）、P110（Vedrantais，原法国材料）、905（引自西甜瓜中期库，原美国品种PMR45）；5个薄皮甜瓜材料：IVF05（引自中国农业科学院蔬菜花卉研究所）、E5（甜宝，原日本材料）、E55（牛角蜜，原地方品种）、E79（白沙蜜，原地方品种）、974（黄皮梨瓜，原地方品种）。材料均经中国农业科学院郑州果树研究所甜瓜遗传育种课题组连续多代自交纯化。

试验于2021年9月至2022年3月在中国农业科学院郑州果树研究所遗传转化实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 种子处理 挑选状态健康的甜瓜种子，加适量常温无菌水浸泡30 min后剥去外种皮，移至超净工作台后，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用2%的次氯酸钠浸泡15 min（其间不断摇晃），无菌水冲洗4～5次，播种于1/2 MS培养基上，在正常光周期条件（25 ℃，光照16 h·d-1，黑暗8 h·d-1，光照度3000 lx）下培养3 d，至子叶由黄转绿时获得无菌苗。

1.2.2 不定芽的诱导培养 选择上述8个基因型的甜瓜材料分别获取无菌苗，将无菌苗子叶沿腹缝线远胚轴端划开（图1），开口深度为0.5 cm左右，接种于添加不同质量浓度的6-BA和ABA（设置10个组合，具体处理见表1）的MS培养基上，在正常光周期条件下培养，进行不定芽诱导，观察不定芽诱导情况。每个处理3个培养皿，每个培养皿接种10个外植体，14 d继代1次，28 d后统计出芽情况，计算不定芽出芽率。根据不定芽出芽率，筛选再生能力最佳的基因型及不定芽诱导阶段最适培养基。

不定芽出芽率/%=出芽外植体个数/接种外植体个数×100。

1.2.3 外植体类型的筛选 选择再生能力最佳基因型材料和最适培养基，设置子叶近胚轴端、子叶远胚轴端和胚轴3种外植体（图2），对其不定芽诱导能力进行探究。在无菌环境下去除无菌苗生长点、根系及大部分胚轴，保留子叶和2 cm左右胚轴，同时将子叶垂直叶脉切割，分成近胚轴端和远胚轴端两部分。将不同类型的外植体接种于最适不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导。每个外植体类型3个培养皿，每个培养皿接种10个外植体，14 d继代1次，28 d后观察不定芽诱导情况，计算不定芽诱导率，筛选最佳外植体类型。

1.2.4 不定芽伸长 不定芽诱导28 d后，将生长状态较好的不定芽丛切下，转移至MS伸长培养基上，在正常光周期条件下培养，设置添加6-BA质量浓度梯度0.1（处理A）、0.2（处理B）、0.5（处理C）、1.0 mg·L-1（处理D）4个处理，每个处理设置3个培养皿，每个培养皿接种10个不定芽。21 d后观察不定芽丛伸长情况，确定不定芽伸长最适培养基。