萝卜种质资源根肿病抗性鉴定与抗性基因遗传分析

摘 要：为探究萝卜不同种质资源对根肿病的抗性情况及抗性遗传规律，采用田间病圃鉴定法，对引自国内外的54份萝卜种质资源进行根肿病抗性鉴定，同时以筛选到的免疫材料与高感材料正反交构建F1、F2群体，采用人工接种鉴定法对群体进行抗性分析。结果表明，54份萝卜种质资源田间发病率0～100%，病情指数0～93.73，共鉴定到免疫级抗性材料2份、抗病材料5份，耐病材料8份，感病材料13份，高感材料26份，其中85.71%抗性材料来自国外种质，而86.05%的国内种质表现感病。以免疫材料白雪公主和高感材料重庆砂罐萝卜杂交获得的F1对根肿病表现免疫，自交后获得F2群体抗性遗传符合3∶1的分离规律，说明白雪公主抗根肿病基因受一对显性核基因控制。研究结果为抗根肿病萝卜育种及抗性基因的发掘奠定了重要基础。

关键词：萝卜；根肿病；抗性；遗传分析

中图分类号：S631.1 文献标识码：A 文章编号：1673-2871（2023）11-016-08

Evaluation of resistance to clubroot disease in radish germplasm and inheritance analysis of resistance genes

RAN Jianzhao1， 2， KONG Chuibao1， YONG Xiaoping1， YANG Feng1， 3， CHEN Lin1， RAN Ke1， RAN Maolin1， 3， LI Xiaomei1， 3

（1. Rice and Sorghum Research Institue， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Deyang 618000， Sichuan， China; 2. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， Sichuan， China; 3. Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan， Chengdu 610300， Sichuan， China）

Abstract： To explored the clubroot disease resistance of different radish germplasm and the inheritance law of resistance genes， the clubroot disease resitance of 54 radish germplasm resources was preliminarily identified by natural induction in the disease nursery field， and then， F1 and F2 populations were constructed by reciprocal cross between the immune material and highly susceptible material， and the resistance of the population was analyzed by artificial inoculation. The results showed that the disease incidence and disease index of 54 radish germplasm resources were 0～100% and 0～93.73， respectively， there were 2 immune resistant materials， 5 resistant materials， 8 resistant-tolerant materials， 13 susceptible materials and 26 highly susceptible materials. 85.71% of the resistant materials came from foreign germplasm， while 86.05% of the domestic germplasm were susceptible. The F1 population constructed by the immune material Snow White and the highly susceptible material Chongqing Shaguan was immune to clubroot disease and the resistance segregation ratio of F2 population was 3∶1， which indicated that the resistance gene of Snow White was controlled by a pair of dominant nuclear genes.

Key words： Radish; Clubroot disease; Resistance; Inheritance analysis

根肿病又称根癌病，是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron）侵染引起的一种土传病害，是造成十字花科作物经济损失最严重的病害之一，威胁和制约着十字花科蔬菜产业的发展[1]。20世纪50年代，十字花科根肿病在我国逐渐流行，至今已蔓延至我国大部分地区，尤其以西南、东南及华中地区危害最重[2]。据统计，根肿病在我国常年危害面积320～400万hm2，产量损失20%～30%[3]。

萝卜（Raphanus sativus L.）是我国重要的十字花科蔬菜作物之一，年平均种植面积约130万hm2，年产量约4.5万t[4]。四川省萝卜种植面积约10万hm2，为四川省第三大蔬菜，其不仅作鲜菜用，也是四川泡菜加工的重要原料之一，在四川现代农业“10+3”产业体系的“川菜”产业发展中占有举足轻重的地位。萝卜为根肿菌的主要寄主之一，目前辽宁、吉林、黑龙江、河南、重庆、湖北、四川一带均有萝卜根肿病发生，部分严重地块甚至出现绝收现象[5-10]。根肿菌休眠孢子在土壤中存活在20 年以上，一旦污染土壤，采用一般的农业防治方法效果较差，而化学方法对环境污染严重，因此选育抗病品种被认为是最经济、安全且有效的防治方法[11]。

种质资源根肿病抗性鉴定与抗性基因遗传分析是培育抗病品种的理论基础。诸多研究表明，萝卜抗性资源主要集中在欧洲、日本，而中国萝卜普遍缺乏抗性基因[12-15]。Rowe[12]对68份萝卜资源进行抗性评价，证实日本及部分法国萝卜品种具有较强的根肿病抗性；Yang等[14]对349份萝卜资源进行抗性鉴定，发现85.06%的中国萝卜表现感病，而大部分国外材料表现抗病；Wang等[15]最新研究表明，82.50%中国萝卜和57.56%的韩国萝卜资源表现出感病。有关萝卜根肿病抗性遗传规律与抗性基因的研究较少，大部分学者认为萝卜根肿病抗性由一对显性主效基因控制[15-19]，目前已定位到2个主效基因位点Crs1[16]、RsCr6[19]，而仅有Gan等[20]认为萝卜根肿病抗性由隐性多基因控制，并定位到5个抗性QTLs。

综上，虽然有关萝卜根肿病抗性研究已取得一定进展，然而相对于其他白菜、甘蓝、油菜等十字花科作物来说还远远滞后[21]。同时，根肿菌存在广泛的生理小种分化现象，单一的抗原容易产生抗性丧失的风险[22-24]。因此，开展更广泛的萝卜种质资源根肿病抗性鉴定，培育对多个生理小种具有抗性的品种具有重要意义。笔者利用田间病圃鉴定筛选抗根肿病萝卜种质资源，然后通过室内接种法对遗传分离群体进行抗性精准鉴定，分析抗性基因遗传规律，为后续品种选育应用、抗性基因定位及抗性机制深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 本试验室内接种的根肿菌均采自四川省眉山市萝卜根肿病发病田，经根肿菌Williams鉴定系统[9]鉴定为4号生理小种，经SCD鉴定系统鉴定为Pb3生理小种（菌样：SCMS-164）[24]。

1.1.2 供试萝卜材料 参与抗根肿病萝卜种质资源田间筛选鉴定的各类萝卜品种/自交系共计54份，均由四川省农业科学院水稻高粱研究所萝卜课题组提供，各材料详情见表1。

1.2 方法

1.2.1 萝卜种质资源根肿病抗性田间鉴定 萝卜根肿病抗性种质资源田间筛选鉴定在四川省农业科学院水稻高粱研究所萝卜课题组建立的根肿病抗性鉴定圃内开展，病圃位于眉山市东坡区农光村，采用水稻与萝卜轮作模式。水稻采收后，于2019年9月，稻田免耕播种萝卜。试验采取随机区组设计，3次重复，每处理种子播种量不少于100粒，播种出苗20 d后，施用少量尿素，保持田间土壤湿度在80%～90%，60 d后进行萝卜根肿病抗性调查。

1.2.2 室内接种鉴定 菌液制备：采集眉山田间发病的萝卜，选择处于发病中期、无皲裂、无腐烂的病根，清洗干净表面泥土，用10%次氯酸钠灭菌5 min，冲洗干净，晾干后，放于-20℃冰箱保存备用。室内接种鉴定时，取适量冻存病根，于培养箱25 ℃活化3 d，再用组织研磨机打碎，8层纱布过滤，用血球计数板于显微镜下观察滤液休眠孢子浓度，将菌液浓度调至1×108个·mL-1备用。

试验处理与培养条件：选择饱满一致的萝卜种子，75%酒精灭菌90 s，无菌水冲洗3次，置于发芽盘催芽，基质于播种前1天浇透水，每处理播种1盘，3次重复，播种深度2 cm左右，每穴播种2颗，每穴注射5 mL菌液后覆盖基质，穴盘放入塑料托盘内，置于光照培养室，于25 ℃、12 h光照条件下培养，接种后3 d内不浇水，中途施用大量溶液水溶肥2次，55 d后调查发病情况。

1.2.3 病情分级及抗性评价标准 病情分级参照甘彩霞等[8]分级标准，略有修改（图1）。

0级，萝卜根系生长正常，无肿瘤；1级，根系的须根或侧根有较少细小肿瘤，主根未发生病害；2级，根系的须根或侧根有较多肿瘤，主根发病较轻，稍微肿大；3级，根系的主根发病较重，异常肿大，大部分须根、侧根有很多肿瘤；4级，根系的主根异常肿大，须根、侧根有很多肿瘤，根瘤总直径超出颈粗5倍以上，或根部出现腐烂，甚至植株死亡。

病情指数（DI）＝∑（发病级代表值×各级病株数）/（调查总株数×最高发病级代表值）×100；（1）

DI=0，免疫（IR）；0＜DI≤10，抗病（R）；10＜DI≤30，耐病（T）；30＜DI≤60，感病（S）；DI＞60，高感（HS）。

发病率/%＝发病株数/观察总株数×100。（2）

1.2.4 抗性基因遗传分析 于2020年4月，利用免疫级抗性材料（白雪公主）与高感材料（重庆砂罐萝卜）正反交获得F1，2021年4月，将F1代材料自交获得F2。2021年7月对亲本、F1、F2代材料开展室内接种鉴定，55 d后调查数据，然后利用Excel对病情调查结果进行χ2检验分析。

2 结果与分析

2.1 萝卜种质资源根肿病抗性田间鉴定

通过田间病圃鉴定发现，不同萝卜种质资源对根肿病抗性存在差异（表2）。54份萝卜种质资源发病率在0～100%，病情指数在0～93.73，其中共鉴定到免疫级抗性材料（IR）2份、抗病材料（R）5份，耐病材料（T）8份，感病材料（S）13份，高感材料（HS）26份。