应用SSR分子标记分析烟台地区黄瓜种质资源遗传多样性

摘    要：以22份黄瓜为材料，利用SSR分子标记技术进行遗传分析，构建22份黄瓜种质的指纹图谱和分子身份证。利用凝胶电泳技术，共筛选出9对SSR引物进行PCR扩增。9对引物一共检测到40个等位基因，每对引物检测出2～9个等位基因，多态性信息含量（PIC）平均为0.42。22份黄瓜种质的遗传相似系数范围是0.25～1.00，在相关系数为0.79时可将22份黄瓜种质分成六类，利用UPGMA法构建聚类分析图，所得分析结果与指纹图谱相符合。研究结果可进一步完善黄瓜种质资源收集与保存，为烟台地区黄瓜主栽品种鉴定和育种研究提供重要参考。

关键词：黄瓜；种质资源；SSR荧光标记；指纹图谱；分子身份证

中图分类号：S642.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）11-024-09

Genetic diversity of cucumber germplasm resources in Yantai region was analyzed by SSR molecular markers

MAN Xiaoyuan， WANG Xiangyi， ZHANG Kaige， HU Ling， CHEN Xiaofeng

（Yantai Institute of China Agricultural University， Yantai  264670， Shandong， China）

Abstract： Using 22 cucumbers as materials， genetic analysis was carried out by using SSR molecular labeling technology to construct fingerprints and molecular ID cards of 22 cucumber germplasm resources. Using gel electrophoresis technology， a total of 9 pairs of SSR primer were screened for PCR amplification. A total of 40 alleles were detected in 9 pairs of primes， and 2 to 9 alleles were detected in each pair of primes， with an average PIC value of 0.42. The genetic similarity coefficient of 22 cucumber varieties ranges from 0.25 to 1.00. When the correlation coefficient is 0.79， 22 cucumber germplasm can be divided into six categories. The UPGMA method is used to construct a cluster analysis map， and the obtained analysis results are consistent with the fingerprint. This study can further improve the collection and preservation of cucumber germplasm resources， and provide an important reference for the identification and breeding of cucumber varieties in Yantai.

Key words： Cucumber; Germplasm resources; SSR fluorescent label; Fingerprints; Molecular identity card

黄瓜（Cucumis sativus L.，2n=14）是葫芦科黄瓜属一年生蔓生植物，是一种世界性蔬菜，又名王瓜、胡瓜、青瓜，在果菜类蔬菜中具有很高的地位[1]。我国是黄瓜生产大国，其栽培面积占世界黄瓜栽培总面积的一半以上，产量和规模均居世界第一位。山东黄瓜地方品种由于栽培历史较久和引入途径不同，加之山东省不同地区气候差异较大，在长期自然和人工定向选择下，形成类型多、品种资源丰富的特点[2-3]。以白黄瓜和地黄瓜为代表的烟台地方黄瓜，因其具有品质优良、营养丰富、口感鲜脆等特点，市场地位不断提高[4-5]。随着市场需求扩大，黄瓜栽培及其选育品种逐渐增多，原优良品种在选育过程中纯度逐渐降低，在生产中重名现象普遍，烟台地区种质资源研究相对落后，导致优质种质流失严重[6]。

21世纪以来，分子生物学得到了突飞猛进的发展，越来越多的分子标记技术相继出现，并逐渐广泛应用于作物遗传育种、植物亲缘关系鉴别、基因库构建等各个领域，例如RFLP、ISSR、RAPD、AFLP、SSR等[7-10]。SSR（Simple Sequence Repeat）称为简单重复序列，具有单基因座、等位基因变异多、多态性丰富、信息量大、稳定性好、操作简单、进化所受选择压力小、特异性强等优点[11]。在众多的分子标记中，SSR能精准识别目标基因DNA片段大小，检测结果可靠、稳定且准确，所以SSR荧光标记常应用于植物遗传分析、分子信息身份证的构建、品种鉴别等方面的研究[12]。王宇晴等[13]利用22对SSR核心引物，研究了111份甜菜登记品种的相关遗传信息，邱杨等[14]从22对引物中筛选出8对，构建了75份萝卜种质资源的分子身份证，徐晓丹等[15]用6对多态性引物将36份小豆品种区分成4个类群。

笔者在本研究中对胶东地区主要栽培的黄瓜品种和全国多地性状及生长特点相似的品种进行遗传多样性分析，利用SSR分子荧光标记技术，构建烟台地区黄瓜的遗传指纹图谱和分子身份证，再对其进行品种划分，最后采用聚类分析法确定各黄瓜品种间的亲缘关系，为烟台地区黄瓜的品种鉴定、种质资源保护和种质创新等提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为22份烟台地区主要栽培的黄瓜种质（表1），其中21份种质来自山东、湖南和河北等省（市）不同种业公司，1份是中国农业大学烟台研究院自育未授权品种。2022年10—12月，于中国农业大学烟台研究院温室播种黄瓜种子，采用随机区组方式于72穴盘种植，每份种质播6穴，培育至2片真叶期后，每份种质随机取2～3片真叶用于本研究。

1.2 方法

1.2.1    基因组DNA的提取与检测    采用上海生物工程有限公司Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒（批号B518261）提取DNA，取新鲜黄瓜真叶0.5 g，经过DNA提取后，用1.4%琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的完整性，再用分光光度计检测样本纯度，保证OD 260/280在1.8以上，合格后将所有样本稀释，以备后续试验。

1.2.2    SSR引物筛选    从近年来发表文献上选用特异性较好的引物[16-25]，引物筛选遵循扩增多态性原则，挑选30对引物。先通过常规PCR扩增检测各引物的多态性，选取多态性较高的9对引物（表2）。

1.2.3    PCR扩增体系    PCR扩增体系如下：1 μL模板DNA（20～50 ng·μL-1），引物F（10 μmol·L-1）和引物R（10 μmol·L-1）各0.5 μL，0.5 μL混合 dNTP（5 μmol·L-1），2.5 μL含MgCl2的Taq缓冲液（10倍），0.2 μL Taq酶（5 U·μL-1），加入ddH2O至25 μL。PCR具体反应采用Touch-down PCR[26]：94 ℃预变性5 min；93 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 次循环；93 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循环；72 ℃修复延伸，10 min；4 ℃保存。合成包含FAM（蓝色）、HEX（绿色）、TAMRA（黑色）3种不同荧光染料的SSR引物，所用SSR引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4    荧光SSR引物检测    采用连续加样器，吸取990 μL HIDI（甲酰胺）和10 μL LIZ-500（分子质量内标）混合均匀，以每孔10 μL分别加入到96孔反应板中。1200 r‧min-1离心15 s后每孔再加入1 μL样品，紧接着再次离心15 s，密封离心30 s后置于PCR仪中，98 ℃变性5 min后立即置于冰水中冷却，待完全冷却后离心15 s，使用ABI 3730 XL型DNA分析仪进行毛细管电泳分析。

1.3 统计分析

对分析仪毛细管电泳输出结果人工读取峰值进行统计，以Excel 2016进行数据整理并保存[27]。使用DataFormater软件[28]将整理的数据转化为各相关软件可以识别的格式，并用PopGen32计算有效等位基因、等位基因、期望杂合度、观测杂合度、Nei’s基因多样性指数和Shannon’s信息指数；用软件Power Marker 3.2统计多态性信息含量（PIC）和基因型数量；用UPGMA法对22份黄瓜种质进行聚类分析[29]。

1.4 DNA分子身份证构建

参考武志江等[30]的方法，将9对引物的扩增带型按从小到大顺序排列，并从“1～9”依次按顺序赋值，超过“9”的从小写字母“a”开始按照字母顺序继续编码，将未检测出结果赋值为“0”，最后将9位数字串联到一起，得出9位独特的字符串即为该种质的DNA分子身份证。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选

利用初步筛选的30对SSR引物对22份种质进行扩增，进一步挑选出扩增条带清晰、稳定性好的引物9对，部分SSR引物扩增结果见图1。

2.2 SSR标记多态性分析

由表3所示，利用9对SSR引物对22份黄瓜种质进行PCR扩增，共检测到40个等位基因位点，平均每对引物检测出4.44个，检测出基因型数量平均4.78个；其中引物SSR10954扩增出的等位基因的数目最多，为9个，引物CSWTAAA01检测出的等位基因的数目最少，为2个；有效等位基因（Ne）的范围为1.10～3.34，平均2.17；期望杂合度（He）的范围为0.09～0.72，平均0.48；观测杂合度（Ho）的范围为0.09～0.73，平均0.29；Nei’s基因多样性指数（H）的范围为0.09～0.70，平均0.47；Shannon’s信息指数（I）的范围为0.22～1.44，平均0.89；多态性信息含量（PIC）的范围为0.09～0.66，平均0.42。9对引物的平均多态性较好，适合进行相关遗传分析和分子身份证的构建。部分种质的荧光检测电泳图见图2。

2.3 SSR指纹图谱的构建

参考黄健婷等[31]的方法，对电泳后的数据进行校正和整理，人工读出等位基因条带，建立22份黄瓜种质的DNA指纹图谱（表4），同时制作数字指纹图谱。将表4中的条带转化为数字0、1，其中“1”代表有扩增条带，“0”代表在相应位点无条带，“9”代表未检测出结果，同时按引物编号顺序和扩增条带片段从小到大顺序，组成一串数字，构成数字指纹图谱[32]（表5）。