高产β-葡聚糖酶木霉菌诱变育种及对黄瓜枯萎病的生防效果

摘 要：为提高木霉菌株的生防潜力，采用紫外线诱变与亚硝基胍处理相结合的方法，对哈茨木霉菌Th-30进行复合诱变育种，测定突变木霉菌株的β-葡聚糖酶活性及生长特性，并评价其β-葡聚糖酶诱导发酵液对盆栽和大田黄瓜枯萎病的防治效果。研究结果显示，6株突变木霉菌株产β-葡聚糖酶能力显著高于亲本菌株，其中突变菌株NU-2产β-葡聚糖酶活性较亲本菌株Th-30显著提高106.36%，且高产酶能力具有遗传稳定性。突变木霉菌株UN-2 β-葡聚糖酶诱导发酵液和β-葡聚糖酶粗酶液对黄瓜枯萎病的室内盆栽防治效果分别为65.29%和63.77%，黄瓜幼苗鲜质量的增重率分别为和30.30%和22.73%。2023年UN-2 β-葡聚糖酶诱导发酵液对不同生育期黄瓜枯萎病的田间防治效果分别为68.47%、71.63%、70.79%和68.65%。综上所述，与亲本菌株Th-30相比，突变木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶活性显著提高，其β-葡聚糖酶诱导发酵液对黄瓜枯萎病具有良好的生防效果，并对黄瓜幼苗具有明显促生作用。

关键词：黄瓜；哈茨木霉；β-葡聚糖酶；诱变育种；枯萎病；生防效果

中图分类号：S642.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）11-064-07

Mutation breeding of Trichoderma harzianum strain for β-Glucanase production and biocontrol effect on cucumber Fusarium wilt

YANG Chunlin1， 2， LI Honghao1， HU Qiang3， XI Yadong1

（1. Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan Province/Institute of Plant Protection， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， Sichuan， China; 2. Leshan Plant Protection and Quarantine Station of Sichuan Province， Leshan 614000， Sichuan， China; 3. Bamboo Diseases and Pests Control and Resources Development Key Laboratory of Sichuan Province， Leshan Normal University， Leshan 614000， Sichuan， China）

Abstract： In order to improve the biocontrol potential of Trichoderma harzianum strain， the combination of ultraviolet mutagenesis and Nitroso guanidine treatment was used to conduct compound mutagenesis breeding of Trichoderma harzianum Th-30. Reducing sugar method was used to determine the β-glucanase activity of the mutant strains， and plate growth method was used to determine the growth characteristics of mutant strains. Pot experiment and field experiment were used to evaluate the control effect of β-glucanase fermentation broth of mutant strain on cucumber Fusarium wilt. The results showed that the ability of six mutants to produce β-glucanase was significantly improved. The activity of β-glucanase induced from mutant strain NU-2 was 106.36% higher than Trichoderma harzianum Th-30， and the ability to produce β-glucanase was genetically stable. The control effects of mutant strain UN-2 β-glucanase fermentation broth and crude β-glucanase solution on cucumber Fusarium wilt were 65.29% and 63.77%， respectively. Strain UN-2 has a certain promoting effect on cucumber growth， with an increase rate of 30.30% and 22.73% on the fresh weight of cucumber seedlings， respectively. The field control effects of UN-2 β-glucanase fermentation broth on cucumber Fusarium wilt at different growth stages of cucumber were 68.47%， 71.36%， 70.79% and 68.65% in 2023， respectively. To sum up， the activity of β-glucanase of mutant strain UN-2 was significantly improved， and its β-glucanase fermentation broth had a good biological control effect on cucumber Fusarium wilt， and had a significant growth promoting effect on cucumber seedlings.

Key words： Cucumber; Trichoderma harzianum; β- Glucanase; Mutation breeding; Fusarium wilt; Biocontrol effect

β-葡聚糖属于非淀粉性多糖，是葡萄糖以β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物[1]。β-葡聚糖除了在植物细胞壁中少量存在外，还是绝大多数病原真菌细胞壁的主要骨架结构成分[2]。β-葡聚糖酶属于水解酶类，广泛存在于细菌、真菌、植物和昆虫中，因来源和序列进化关系的差异，其结构和催化功能呈现多样性，目前关于具有应用潜力的不同来源的β-葡聚糖酶的报道很多[3]。外源β-葡聚糖酶通过催化葡聚糖多聚体的水解而抑制病原真菌的生长及增殖[4]，在环境污染和农产品质量安全问题日益突出的今天，作为具有生防功能的生物酶类，β-葡聚糖酶在植物真菌病害防治方面具有很大的研究应用价值。

获得β-葡聚糖酶的途径主要有两种，一种是从动植物体内分离提取[5-6]，另一种则是通过微生物发酵。目前报道产β-葡聚糖酶的微生物主要有芽孢杆菌[7-8]、镰刀菌[9]、曲霉菌[10-11]、木霉菌等[12-13]。其中，木霉菌因同时具有空间占位、降解病原菌细胞壁及诱导植物产生防御抗性等多种生防机制，是重要的植物病害生物防治菌[14-16]。由于筛选技术等方面的局限，野生菌株的产酶能力比较低，往往采取人工育种的方式对菌株进行改良[17-19]以获得理想菌株。诱变育种通过诱变剂处理提高菌种的突变概率和变异幅度，从而选出具有优良特性的变异菌株[20]。四川省农业科学院植物保护研究所生防实验室以往的研究表明，哈茨木霉菌株Th-30对多种蔬菜作物具有防病促生效果[21-22]。笔者采用紫外线照射与亚硝基胍处理相结合的方法对哈茨木霉菌株Th-30进行诱变，选育β-葡聚糖酶高产突变菌株，提高其生防潜力，并评价突变木霉菌株β-葡聚糖酶诱导发酵液对黄瓜枯萎病的防治效果，以期为黄瓜枯萎病生物防治提供新的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

哈茨木霉菌Trichoderma harzianum Th-30、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum由四川省农业科学院植物保护研究所生防实验室保存；3%氨基寡糖素由河北嘉和生物科技有限公司生产；2%春雷霉素由江西省赣州宇田化工有限公司生产；β-葡聚糖、葡萄糖标准品由德国Sigma公司生产；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试剂及培养基制备

1.2.1 试剂配制DNS试剂 3，5-二硝基水杨酸3.15 g、酒石酸钾钠91 g、NaOH 20 g、无水亚硫酸钠2.5 g、苯酚2.5 g、ddH2O 1000 mL；亚硝基胍（NTG）溶液：NTG结晶10 mg、助溶剂甲酸铵0.05 mL、pH 6磷酸盐缓冲液配成4000 μg·mL-1原液。

1.2.2 培养基制备 初筛培养基（1 L）：l g·L-1 β-葡聚糖、3 g·L-1 NaNO3、0.6 g·L-1去氧胆酸钠、1 g·L-1 K2HPO4、0.01 g·L-1 FeSO4·7H2O、0.5 g·L-1 MgSO4·7H2O、0.5 g·L-1 KCl、18 g·L-1琼脂，4 g·L-1的刚果红溶液3 mL。葡聚糖诱导培养基：1 g·L-1 β-葡聚糖、5 g·L-1蛋白胨、10 g·L-1燕麦粉、1 g·L-1 KH2PO4、0.1 g·L-1 CuSO4·5H2O、0.1 g·L-1 CaCl2·2H2O、0.08 g·L-1 MnCl2·4H2O、0.1 g·L-1 MgSO4·7H2O、0.07 g·L-1 ZnSO4·7H2O、0.05 g·L-1 CoCl2·6H2O、0.01 g·L-1 FeSO4·7H2O。

1.3 木霉菌的复合诱变育种

1.3.1 单孢子悬液的制备 诱变试验于2021年7－11月在四川省农业科学院植物保护研究所病害实验室进行。取斜面保存的木霉菌种，于30 ℃条件下活化培养，用无菌生理盐水冲洗孢子制成悬液，倒入无菌三角瓶中，塞紧棉塞并用无菌牛皮纸包扎瓶口，充分振荡形成单孢子悬液，用灭菌的脱脂棉过滤，血球计数板计数，调整孢子浓度为106 CFU·mL-1。

1.3.2 紫外诱变 移取单孢子悬液5 mL加至无菌培养皿，放入无菌磁力搅拌子，用黑纸包住后置于磁力搅拌器上，距15 W紫外灯30 cm处诱变5～45 min。移取经紫外线照射的孢子悬液，将孢子浓度调整为104 CFU·mL-1，取0.1 mL孢子悬液涂布于初筛培养基上，用黑纸包住于30 ℃培养72 h后统计菌落数，计算致死率。从致死率为70%～80%的平板中挑取生长旺盛、透明圈大的菌落，接种于刚果红鉴定平板上，于28 ℃恒温培养48 h，连续转接3次，观察记录菌落生长和透明圈产生情况。选取透明圈直径/菌落直径较大的菌株，培养至对数生长期后按1.3.1的方法制成单孢子悬液进行下一步试验。

1.3.3 亚硝基胍诱变 将5 mL单孢子悬液、1 mL NTG溶液加入离心管中，充分混匀，28 ℃水浴振荡5～45 min，离心后去上清液，用无菌水洗涤菌体3～5次以终止NTG的诱变作用；加入5 mL无菌生理盐水，充分摇匀，取0.1 mL孢子悬液涂布于初筛培养基上，于28 ℃黑暗培养72 h后统计菌落数，并计算致死率。从致死率70%～80%的平板中挑取菌落进行培养，观察记录菌落生长和透明圈产生情况，选取透明圈直径/菌落直径较大的菌株保存备用。

1.3.4 突变菌株β-葡聚糖酶粗酶液的制备 将突变菌株在PDA培养基上活化培养至产生大量绿色分生孢子，用5 mL无菌水冲洗并收集分生孢子液，将孢子浓度调整到106 CFU·mL-1后接种到葡聚糖诱导培养基上，于28 ℃、150 r·min-1振荡培养64 h，得到木霉β-葡聚糖酶诱导发酵液。将发酵液于4 ℃、5000 r·min-1离心10 min，取上清液。在上清液中加入分散的硫酸铵，搅拌均匀后于室温静置过夜，将盐析液于4 ℃、8000 r·min-1离心20 min，去上清液，加入5 mL磷酸盐缓冲液充分溶解，若出现浑浊现象则再次离心10 min；将上清液用0.20 μm微孔滤膜过滤，除去分生孢子即得β-葡聚糖酶粗酶液，于4 ℃保存备用。