山药炭疽病病原菌的分离鉴定及其室内毒力测定

摘    要：为了明确湖南双峰青树坪山药炭疽病的病原菌种类及筛选适合的化学药剂，将采集的山药炭疽病病样通过组织分离法结合形态学和分子生物学分析对分离菌株进行分离鉴定，采用喷雾接种法测定致病性，采用菌丝生长速率法测定4种化学药剂对山药炭疽病的毒力。结果表明，引起该地区的山药炭疽病病原菌是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）；5%己唑醇悬浮剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、32.5%苯甲嘧菌酯悬浮剂3种化学药剂对山药炭疽病病原菌均具有较好的抑菌效果；山药炭疽病菌对药剂32.5%苯甲嘧菌酯悬浮剂最为敏感，其EC50为0.020 4 mg·L-1。试验结果可为山药炭疽病害的防治提供参考。

关键词：山药；炭疽病；胶孢炭疽菌；病原鉴定；室内毒力测定

中图分类号：S632.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）11-122-05

Isolation and identification of pathogen of yam anthracnose and laboratory test of virulence

CHEN Gong1， YI Siqing1， JIN Chenzhong1，2， GUO Kaifa1，2， HU Biao1， DUAN Qiuyuan1

（1. Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control/Hunan University of Humanities， Science and Technology， Loudi 417000， Hunan， China; 2. Loudi Institute of Agricultural Science， Loudi 417000， Hunan， China）

Abstract： In order to identify of pathogenic species and screen suitable chemical agents for the anthracnose disease of Hunan Shuangfeng Qingshuping Yam. The collected samples of Yam anthracnose were separated and identified by tissue separation method combined with morphology and molecular biology. The pathogenicity was determined by spray inoculation method， and the virulence of 4 chemical agents to Yam anthracnose was determined by mycelium growth rate method. The results indicate that the pathogen causing Yam anthracnose in the region is Colletotrichum gloeosporioides. The chemical agents of 5% hexaconazole SC， 10% difenoconazole WG and 32.5% benzoyl-azoxystrobin SC had good antibacterial effect on the pathogen of Yam anthracnose， among which the pathogen of Yam anthracnose was most sensitive to 32.5% benzoyl-azoxystrobin SC， with its EC50 value of 0.020 4 mg·L-1. This can provide reference for the prevention and control of anthracnose disease.

Key words： Yam; Anthracnose; Colletotrichum gloeosporioides; Pathogen identification; Indoor toxicity test

山药（Dioscorea opposita Thunb.）即淮山，为薯蓣科薯蓣属植物[1]。青树坪淮山是国家地理标志产品，也是湖南地方特色品种，产自“全国重点镇”湖南双峰青树坪镇，具有山药界的“丑”山药之名，青树坪山药外形毛多、疙瘩多、弯曲不整齐，但口感细腻，性粉，粉中带糯，可媲美河南铁棍山药。其主产区土壤有机质含量高，微量元素丰富，经国家农业农村部农产品质量监督检验测试中心检测，青树坪山药中的硒元素含量较丰富，已经达到国家“富硒产品”要求，长久食用既可以提高身体素质，又能增强人体的免疫功能[2]。

近年来，随着农业产业结构调整和市场需求量的不断增加，双峰青树坪山药种植面积逐年扩大，病害问题日益突出。当山药茎叶受到炭疽病危害后，受害区域一般减产20%～30%，严重时在50%以上。炭疽菌属（Colletotrichum）是一种分布范围广、寄主植物多、侵染能力强的真菌性病害，危害柑橘、草莓、高粱和玉米等多种农作物从而引发炭疽病，导致严重的经济损失[3-4]。炭疽病病原菌的分生孢子主要通过风雨传播，有时昆虫也能作为传播媒介，孢子萌发后即可从气孔、皮孔等自然孔口入侵，也可以从伤口入侵[5]。天气条件适宜尤其高温高湿、种薯品质不佳、种植不合理、农业管理措施不当和农药使用不科学等都会引起炭疽病，造成严重的经济损失[6]。已有文献报道，引起山药炭疽病的主要病原菌有胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[7-8]、薯蓣盘长孢菌（Gloeosporium pestis）和辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）[9]，不同地区山药炭疽病的病原菌种类不同。笔者研究的山药病叶源于双峰青树坪镇的山药种植基地，将采集到的山药炭疽病病叶进行组织分离，结合致病性测定、形态学特征观察和分子生物学分析，明确山药炭疽病病原菌种类及筛选适合的化学药剂，可为双峰县山药炭疽病害的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2022年6月在湖南娄底市双峰县巡胜蔬菜种植专业合作社山药基地采集山药炭疽病样品，品种为湖南地方特色品种青树坪山药，共采集样品9份。

供试杀菌剂：5%己唑醇悬浮剂（上海沪联生物药业（夏邑）股份有限公司）；32.5%苯甲嘧菌酯悬浮剂（上海沪联生物药业（夏邑）股份有限公司）；10%苯醚甲环唑水分散粒剂（先正达南通作物保护有限公司）；70%丙森锌可湿性粉剂（拜耳股份公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原物的分离与纯化 采用组织分离法[10]对典型的山药炭疽病病样进行分离纯化。取典型的山药炭疽病叶，放入超净工作台中，用75%乙醇擦拭干净，待叶片自然干燥后，取病健交界部位的叶组织（大小约为5 mm × 5 mm）浸泡在2%次氯酸钠溶液中1 min，用无菌水漂洗3次后放置在无菌滤纸上，使其干燥，然后接入PDA平板，处理完成后放置培养箱中培养，2 d后在WA平板上进行单孢纯化，经多次纯化，将分离物接种在PDA斜面试管中并培养一段时间后置于4 ℃冰箱保存，以备后续试验使用。

1.2.2 病原菌形态学特征 将病原菌PDA培养基放入恒温培养箱中（25 ℃）培养10 d，制作临时玻片，对菌落形态、色泽、大小、分生孢子等进行观察拍照。在显微镜下参照张天宇[11]的方法观察分生孢子和孢子梗以及产孢细胞的形态和大小特征进行分类。

1.2.3 致病性测定 选用长势健康的山药叶片进行田间标记，对健康山药叶片采用孢子悬浮液进行喷雾接种完成致病性测定。在已分离纯化的菌落上用灭菌的打孔器（直径=5 mm）打取数个菌饼，将其置于PD液体培养基中，放入恒温摇床，诱导产孢，使用血球计数板计数7 d后的孢子浓度，用无菌水将其调整为1×106个孢子·mL-1。将健康山药叶片用75%酒精表面消毒后，使用无菌接种针进行划伤处理，用喷雾壶将孢子悬浮液均匀喷洒，以不接种孢子悬浮液的健康山药叶片作为对照，将接种后的山药叶片用套袋保湿培养48 h，3次重复，定期观察病斑生长情况，拍照记录以及测量病斑直径，观察是否与田间病斑一致，同时对发病部位进行组织分离，比较是否与最初分离接种的发病菌株菌落特征和分生孢子形状相同，确认其致病性。

1.2.4 分子鉴定 取PDA培养基上具代表性菌株的菌丝组织，研磨后用DNA提取试剂盒，提取病原物的基因组DNA。使用引物ITS1/ITS4[12]进行PCR扩增。PCR反应体系：总体积为50 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye） 25 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 20 μL。PCR扩增反应程序为：94 ℃ 4 min、94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，30个循环，72 ℃ 10 min。反应完成后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序完的基因序列进行校正处理，然后在核酸序列数据库GenBank当中搜索比对同源序列，对比分析代表菌株与数据库已知的相关序列的同源百分率。代表菌株根据ITS基因的扩增序列，然后利用MEGA 7软件，通过自展法（bootstrap）构建系统发育树。

1.2.5 病原物的室内毒力测定 采用菌丝生长速率法进行室内毒力测定。供试杀菌剂有5%己唑醇悬浮剂、32.5%苯甲嘧菌酯悬浮剂、70%丙森锌可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂。在预试验的基础上，分别吸取各化学药剂滴入PDA培养基的培养皿中（V化学药剂：VPDA培养基=1∶9），混匀，冷却凝固备用，每个浓度梯度3次重复。4种供试杀菌剂的最终质量浓度分别为32.5%苯甲嘧菌酯（650、325、162.5、81.25、40.625 mg·L-1），5%己唑醇悬浮剂（100、50、25、12.5、6.25 mg·L-1），70%丙森锌（1400、700、350、175、87.5 mg·L-1），10%苯醚甲环唑（5、2.5、1.25、0.625、0.321 5 mg·L-1），对照组则是在培养基中加入等量无菌水。使用已灭菌打孔器（直径=5 mm）在分离纯化后的菌落中打取菌饼1块，将其接种在PDA平板中央，放置恒温培养箱中（25 ℃）培养，用十字交叉法测量7 d后的培养基菌落直径，记录数据，得出菌丝生长抑制率。求毒力回归方程，计算EC50及相关系数。

抑制率/%=[1-（处理菌落直径-菌饼直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）]×100；

农药质量浓度/（mg·L-1）=（含量百分数/稀释倍数）×106。

1.3 数据处理

使用Excel 13.0进行数据分析和绘图制表。

2 结果与分析

2.1 山药炭疽病田间症状及致病性测定

田间调查可见，山药炭疽病发病初期为不规则的褐色小点，周围伴有明显的黄色晕圈，病斑扩大后中间凹陷，颜色呈浅灰褐色，边缘呈黑褐色，病健界限明显，见图1。将病原菌离体接种到健康山药叶片上，接种3 d后观察试验接种症状，发病叶片病斑中间部位下陷，呈暗灰色，边缘呈黑褐色，与田间观察一致，空白处理不发病，见图1。并且对发病病斑进行组织分离法后可重新分离鉴定为同一种病原菌。

2.2 病原菌形态特征

从采集的9份山药炭疽病病叶中分离得到9份病原菌，获得纯培养后观察（图2），菌落正面菌丝较为致密，呈褐绿色毛毡状，并形成几圈散落的橙红色孢子堆，具同心轮纹（图2-A）。显微镜下观察分生孢子为无色、圆桶形、两端钝圆、光滑、单孢、内有油滴状颗粒物，大小为（14.4～19.7）μm×（4.6～5.9）μm（n=50）（图2-C）。根据真菌分离物形态特征，初步鉴定为炭疽菌属（Colletotrichum）。