一株甜瓜枯萎病拮抗菌的筛选、鉴定及生防效果

摘    要：为获得对甜瓜病原菌具有生防潜力的菌株，采用稀释涂平板和分子鉴定的方法，从连续多年种植甜瓜大棚的土壤中分离获得菌株Bc1-20，鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。为筛选到对甜瓜多种病害的病原菌具有拮抗作用和对甜瓜具有促生作用的菌株，采用平板对峙法、苗期灌根和盆栽接种试验。结果表明，Bc1-20对甜瓜多种真菌病害的病原菌均有抑制作用，例如，尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. melonis）、黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）、蔓枯病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum）、腐皮镰刀菌（F. solani）和亚洲镰刀菌（F. asiaticum）；Bc1-20处理甜瓜幼苗的茎粗、茎长、鲜质量、子叶长宽及最大真叶的长和宽方面都极显著高于空白对照，表明铜绿假单胞菌Bc1-20对甜瓜幼苗有促生作用；Bc1-20处理的甜瓜幼苗枯萎病的病情指数为40.80，空白对照组的病情指数为85.65，Bc1-20处理的相对防治效果为52.34%。综上，铜绿假单胞菌Bc1-20具有生防潜力，可很好地防治甜瓜枯萎病。

关键词：甜瓜；铜绿假单胞菌；Bc1-20；甜瓜枯萎病；生防潜力

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）12-026-07

Screening， identification and biocontrol effect of antagonistic bacteria against melon Fusarium wilt

HAO Fangmin1， DONG Wenjie2， ZANG Quanyu1， MA Erlei1， DING Weihong1， WANG Yuhong1

（1. Ningbo Key Laboratory of Characteristic Horticultural Crops in Quality Adjustment and Resistance Breeding/Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， Zhejiang， China; 2. Zhejiang Wanli University， Ningbo 315040， Zhejiang， China）

Abstract： To obtain effective biocontrol fungi against melon pathogens， dilute coated plates and molecular identification methods were used， strain Bc1-20 was isolated from the melon greenhouse planted for many years， and was identified as Pseudomonas aeruginosa. In order to screen the strains that have antagonistic and growth promoting effects， the experiments of plate confrontation， root irrigation and pot inoculation method were carried out. The result showed that Bc1-20 had good inhibitory effect on the pathogen of various fungal diseases of melon， such as Fusarium oxysporum， Monosporascus cannonballus， Stagonosporopsis cucurbitacearum， F. solani and F. asiaticum， and showed strong antagonistic activity on the plate. Furthermore， P. aeruginosa Bc1-20 could promote the growth of melon seedlings， and significantly increased the stem diameter， fresh weight， length and width of cotyledon and the length and width of the largest true leaf of melon seedlings compared with the control. In addition， pot experiment also showed that it had biocontrol potential to control the melon fusarium wilt and the relative control effect was 52.34%. P. aeruginosa Bc1-20 has the potential of biocontrol and can effectively control muskmelon wilt.

Key words： Melon; Pseudomonas aeruginosa; Bc1-20; Fusarium wilt; Biocontrol potential

甜瓜是世界十大水果之一，也是我国广泛栽种的经济作物之一。在甜瓜种植面积不断扩大、产量和经济效益稳步上升的同时，甜瓜病害却日益严重，特别是甜瓜枯萎病、根腐病、蔓枯病等病害，极大地影响了甜瓜的产量和品质，限制甜瓜产业的可持续发展。其中，甜瓜枯萎病由尖孢镰刀菌甜瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. melonis）引起，是一种土传病害，在甜瓜全生育期均可发生，通常造成瓜田植株大片死亡[1]。甜瓜根腐病和黑点根腐病分别是由腐皮镰刀菌（F. solani）[2]和坎诺单孢菌（Monosporascus cannonballus）[3]引起的土传病害，均可引起根腐病，造成甜瓜藤蔓急性凋萎，严重时甚至绝收。甜瓜蔓枯病是由Stagonosporopsis cucurbitacearum引起的病害，主要危害茎蔓和叶片，该病发病极快，一旦发生蔓延很难控制[4]。由亚洲镰刀菌（F. asiaticum）引起的甜瓜果腐病，多危害半成熟和成熟的果实，发病初期果实呈水渍状病斑，后期内部开始腐烂，该病害初期不易发现，不能够及时进行防治，一旦发生，严重影响果实的品质和产量[5-6]。

目前针对上述病害主要使用传统的化学防治方法，但是会造成环境污染和农药残留超标等问题，对人们的健康及生态环境造成严重的危害，甚至可能导致社会普遍关注的食品安全问题。因此，急需采用高效、无公害的生物技术防治甜瓜病害，生物防治具有安全、绿色、高效等优点，对甜瓜产业的可持续发展具有重要意义。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性菌，是植物根际微生态和土壤中的优势微生物种群之一，该菌能分泌多种拮抗植物病原菌的代谢产物[7]，对维持其生态适应性和在复杂的根际环境中繁殖生存有重要意义，可以防治多种植物真菌或细菌类病害，作为新型生物农药已在防治植物病害中广泛应用[8]。而同时对甜瓜枯萎病菌、黑点根腐病菌、蔓枯病菌、腐皮镰刀菌和亚洲镰刀菌同时有效的生防菌较少，因此，筛选对甜瓜不同病原菌同时有效的生防菌株具有重要的理论和实践意义。

笔者的研究在连续多年种植甜瓜大棚的土壤中分离到一株铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）Bc1-20，对甜瓜多种病原菌均有抑制作用，平板拮抗活性很强，于是进一步测定了Bc1-20对甜瓜幼苗的促生作用及甜瓜枯萎病的防治效果，以期为甜瓜病害生防菌剂的开发应用奠定基础，为甜瓜病害的绿色防控提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病原菌：尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F. oxysporum）TG-5、黑点根腐病菌（M. cannonballus）Mc-30、蔓枯病菌（S. cucurbitacearum）MF-17[9]、腐皮镰刀菌（F. solani）NG-3[10]和亚洲镰刀菌（F. asiaticum）Fa-25[11]等5种，均由笔者实验室分离获得，在PDA培养基上进行活化，作为供试菌株。供试甜瓜品种为厚皮甜瓜材料48号，由宁波市农业科学研究院提供，所有试验在宁波市特色园艺作物品质调控和抗性育种重点实验室、宁波市高新农业技术实验园区完成，时间是2023年4—7月。

NA培养基：牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水1000 mL，pH 7.0。NB培养基：牛肉浸膏10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、水1000 mL，pH 7.0。PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂15 g、水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 铜绿假单胞菌Bc1-20的分离和鉴定 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）Bc1-20是从宁波市高新农业技术实验园区的连续多年种植甜瓜大棚的土壤中分离得到的，具体做法为：取甜瓜大棚的土壤1 g放到1.5 mL的无菌水中，混匀，然后稀释涂平板，挑取单菌落在NB培养基中，温度28 ℃、转速150 r·min-1 条件下进行摇培，再次对单菌落进行划线纯化。利用在NB培养基中28 ℃摇培24 h的菌液分别对病原菌进行对峙培养，将具有拮抗作用的细菌采用甘油保存在-70 ℃的冰箱内，铜绿假单胞菌Bc1-20于2023年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 26547。

1.2.2 铜绿假单胞菌Bc1-20的分子鉴定 铜绿假单胞菌Bc1-20的分子鉴定过程包括：采用50 μL的PCR反应体系进行16S rDNA的扩增、测序及系统发育进化分析。拮抗细菌的基因组DNA用全式金细菌基因组试剂盒提取。扩增菌株的16S rDNA采用细菌通用引物（27F：5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’；1492R：5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’）进行扩增[12]，扩增的PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测，对阳性PCR产物进行纯化、克隆和测序[13]。将测得的16S rDNA序列在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行核酸比对，利用软件MEGA 7.0[14]构建系统进化树，明确拮抗菌的分类地位。

1.2.3 铜绿假单胞菌Bc1-20的生长曲线和活菌数测定 将铜绿假单胞菌Bc1-20菌株取出，在NA平板上划线活化，转代1次后挑取单菌落接种于NB液体培养基（100 mL）摇培，在温度28 ℃、转速150 r·min-1条件下摇培，每间隔4 h取样，直至56 h结束，取样测量OD600值和活菌数等数据。

1.2.4 铜绿假单胞菌Bc1-20的防病拮抗效果试验 采用平板对峙法进行防病拮抗菌株的筛选，在PDA培养基上活化尖孢镰刀菌甜瓜专化型菌、蔓枯病菌、黑点根腐病菌、腐皮镰刀菌和亚洲镰刀菌等病原菌，用直径5 mm的打孔器在新鲜的菌落边缘打孔，挑取新鲜菌丝块接种在新的PDA平板中心，用接种环挑取少量新鲜绿假单胞菌Bc1-20菌液于PDA培养基的两端划线，划线处距PDA端部距离为1 cm，封口膜封好后置于25 ℃培养箱中黑暗培养，10 d之后统计试验结果，每个菌株3个皿。对照组只接种病原菌，不接种绿假单胞菌Bc1-20[15]。

1.2.5 铜绿假单胞菌Bc1-20的促生试验 在温室大棚中，利用盆栽试验进行拮抗细菌对甜瓜幼苗的促生试验，在甜瓜种子播种3、7、10 d后，用拮抗细菌配置的108 cfu·mL-1悬浮菌液对甜瓜幼苗进行灌根：用移液器将悬浮菌液沿甜瓜幼苗根部灌入，每棵幼苗用1 mL菌液处理，共计150棵，同时以NB培养基处理的甜瓜幼苗作为对照。17 d后，拔出完整的甜瓜幼苗，每个处理取生长一致的30棵幼苗，只保留地上部分，测量幼苗的茎粗、茎长、子叶长和宽、每株幼苗中最大真叶的长和宽及地上部分鲜质量，统计分析数据。

1.2.6 甜瓜枯萎病的盆栽生防试验 在甜瓜播种后的3、7、10 d，用108 cfu·mL-1的铜绿假单胞菌Bc1-20悬浮菌液对甜瓜幼苗进行灌根，每棵幼苗用1 mL菌液处理。每个处理对应1个穴盘，每个穴盘50株，设置3次重复。同时用NB培养基处理的甜瓜幼苗作为CK组。