土壤改良措施对土壤微生态和西瓜苗期枯萎病防治的影响

摘    要：由尖孢镰孢菌侵染导致的枯萎病是西瓜生产上最严重的病害之一。为探索不同土壤改良措施对西瓜枯萎病的防治效果，利用盆栽试验，对含有西瓜枯萎病病原菌的栽培基质进行土壤改良和微生物多样性分析。结果表明，与病土对照相比，高温处理下部分土壤酶活性降低，但枯萎病发病率降低至14.13%，且土壤真菌丰度和多样性提高；淹水处理同时降低了枯萎病的发病率、土壤养分含量和土壤酶活性，但提高了土壤细菌丰度；枯草芽孢杆菌和哈茨木霉菌制剂处理对土壤速效养分含量、土壤酶活性、土壤细菌和真菌的丰度及多样性均有所提高，但对西瓜苗期枯萎病的防治效果并不明显。研究结果揭示了不同土壤改良方法对西瓜苗期枯萎病防治和土壤微生态环境的影响，可为生产上克服西瓜连作障碍提供参考。

关键词：西瓜枯萎病；土壤改良；土壤酶活性；微生物多样性

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）12-016-10

Effects of soil improvement measures on soil microecology and the management of Fusarium wilt in watermelon seedlings

CHEN Zibiao1， 2， YI Licong2， LI Qingke2， 3， ZHOU Wei2， WANG Yunqiang2， WU Na2， JIAO Chunhai4， XIAO Bo1， DAI Zhaoyi2

（1. College of Horticulture and Gardening， Yangtze University， Jingzhou 434000， Hubei， China; 2. Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement/Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 3. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434000， Hubei， China; 4. Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China）

Abstract： Fusarium wilt （Fusarium oxysporum f. sp. Niveum （FON））is one of the most serious diseases in watermelon production. This study aimed to evaluate the effect of different soil improvement methods in controlling watermelon fusarium wilt. The cultivation substrate containing FON conidia （race 1） was subjected to improve using high temperature， waterlogging， and microbial agent addition in greenhouse， and then fusarium wilt incidence of watermelon seedlings， soil nutrient levels， soil enzyme activities， and microbial community diversity were analyzed. The results showed that high temperature treatment reduced some soil enzyme activities， however， significantly reduced the fusarium wilt incidence， which dropped to only 14.13%， and increased the abundance and diversity of soil fungi. After waterlogging treatment， the wilt incidence was significantly reduced， soil nutrients and soil enzyme activities were also reduced， but soil bacterial abundance was increased. The addition of Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum agents improved the content of soil available nutrients， soil enzyme activities and the abundance and diversity of soil bacteria and fungi， however， had barely effect on wilt control. The findings of this study revealed the effects of different soil improvement methods on watermelon fusarium wilt control and soil microecological environment， and provided theoretical basis for overcoming the obstacles of continuous cropping in watermelon production.

Key words： Fusarium wilt; Soil improvement; Soil enzyme activity; Microbial diversity

西瓜是我国重要的园艺作物之一，种植历史悠久，深受大众喜爱。枯萎病是西瓜生产上危害最严重的病害之一，是一种由尖孢镰孢菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，FON）侵染引起的一种在世界范围内广泛发生的真菌性土传病害，主要通过土壤传播，也可由种子传播[1]。目前共发现和鉴定出4个西瓜枯萎病生理小种：生理小种0、1、2和3，其中生理小种1是造成我国西瓜枯萎病的优势生理小种[2]。研究表明，随着连作年限的增加，西瓜枯萎病病原菌迅速累积，土壤中镰孢菌属（Fusarium）真菌相对丰度快速上升，破坏西瓜根际土壤微生物群落结构，导致土壤生态系统失衡，西瓜枯萎病发生严重[3]。

微生物是土壤生态系统的重要组成部分，对推动土壤养分循环、改善土壤环境、促进植物生长发育起重要作用[4]。土壤酶在土壤-微生物-植物系统中起到关键的转化作用，土壤理化性质、土壤酶活性和土壤微生物多样性互相影响，且关系密切[5]。温度是影响土壤微生物群落结构和活性的重要因素，高温闷棚是最常见的西瓜枯萎病防治手段之一[6]。Zhang等[7]研究发现，草原平均气温升高1.8 ℃，明显提高了土壤真菌的活性和丰度，进而提高了对菌类中一些酶的利用效率，极大地影响了土壤微生物群落结构。淹水处理也是生产上防治枯萎病的常见措施，研究发现，淹水处理可以通过影响土壤养分的利用率，加大土壤微生物群落结构的差异，增加根瘤菌、假单胞菌等有益菌的相对丰度[8]。施用微生物菌剂是新兴的绿色土壤改良措施，是影响微生物群落结构最直接的方式之一，研究表明，不同类型外源有机物的投入对土壤微生物种群数量及其群落结构调控的机制存在着显著差异[9-10]。

生产上常见的防治西瓜枯萎病的方法包括嫁接、化学消杀、轮作、夏季高温闷棚、添加微生物菌剂等[11]。但是，嫁接导致生产成本增加且可能影响果实品质[12]，而化学防治存在抗药性、安全性和环境污染等问题[13]。随着设施西瓜的不断发展和市场对高品质西瓜需求的增加，生产上急需简单实用、绿色安全的西瓜枯萎病防治技术。但是，目前大部分对土壤改良防控西瓜枯萎病的研究局限于单一的防治效果比较或仅基于单个改良措施[5，12，14]，而针对不同土壤改良处理后土壤理化性质、酶活性和土壤微生物群落等变化的研究报道还很少。笔者对混有FON分生孢子的栽培基质进行物理和生物处理，通过综合比较不同土壤改良措施对土壤微生态环境的影响，分析了土壤改良措施缓解西瓜枯萎病的作用机制，为生产上西瓜枯萎病的绿色防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

抗病西瓜自交系2W137和感病对照材料Sugar baby来自湖北省农业科学院经济作物研究所瓜类组团队；供试病原菌为西瓜枯萎病病原菌1号生理小种，由浙江大学李大勇教授提供。

1.2 枯萎病人工接种

试验于2022年9月至2023年2月在湖北省农业科学院经济作物研究所人工培养室完成。枯萎病病菌在PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖15 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1000 mL）上28 ℃黑暗条件下培养3 d，从菌落边缘取直径5 mm的菌饼3块，接种在含有100 mL PDA培养基的三角瓶中，28 ℃ 250 r·min-1振荡培养5 d，取培养好的菌液用4层纱布过滤，除去菌丝，得到孢子悬浮液。用血球计数板记录孢子悬浮液孢子数，并将孢子悬浮液稀释为不同浓度备用。西瓜种子表面消毒后用55 ℃温汤浸泡约3 h，然后置于30 ℃温箱催芽，待胚根长0.5 cm左右时播种。采用浸根接种法作为西瓜枯萎病抗性鉴定对照，即在西瓜幼苗子叶平展期将根洗净，用5×106个·mL-1孢子悬浮液浸泡15 min后移栽。其他处理采用菌土混合接种法，枯萎病菌菌液接种浓度设5个梯度处理，分生孢子浓度分别为1×106、5×105、1×105、5×104、1×104 个·mL-1。选用灭菌基质与菌液量按体积比5∶1混合均匀，分装于50孔穴盘，然后播种，每穴1粒。每个穴盘各播种抗病和感病材料20粒，设3次重复，分别于接种后9、12、15、18 d统计病株率。

1.3 土壤改良处理

以生产上常见的枯萎病防治土壤改良措施设置6个处理：高温消杀（Fon_HT，70 ℃，7 d）、淹水（Fon_FL，水位高于基质2 cm，淹水14 d）、哈茨木霉菌制剂（Fon_T_har，2 g·L-1，有效活菌数≥100亿·g-1）、枯草芽孢杆菌制剂（Fon_B_sub，2 g·L-1，有效活菌数≥400亿·g-1）、菌土对照（Fon）、健康土对照（CK）。西瓜材料选用感病种质Sugar baby，每个处理50株，设3次重复。

1.4 土壤理化性质和酶活性测定

采用五点取样法，在播种后18 d，分别对6种处理的西瓜幼苗根际土壤进行取样，混匀后分成小份备用。使用土壤养分速测仪测定土壤有效磷、有效钾、铵态氮含量。使用ELISA试剂盒测定（北京索莱宝生物股份有限公司）土壤过氧化氢酶（S-CAT）、土壤脲酶（S-UE）、土壤多酚氧化酶（S-PPO）、土壤纤维素酶（S-CL）、土壤蔗糖酶（S-SC）活性。

1.5 土壤微生物多样性测定

采用试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司）提取土壤基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度。分别采用IST1/ITS4和338F/806R通用引物进行ITS和16s rDNA扩增，PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳回收纯化后送至分子标记（武汉）生物育种有限公司测序，每个样品3次重复。利用Trimmomatic对Fastq测序数据进行质控，随后用Flash软件对两端序列进行拼接。根据已知数据库用uchime方法比对去除Fasta序列的嵌合体，对未知数据使用自比对（Denovo）方法进行去除，同时去除不合要求的短序列。使用QIIME2平台进行微生物多样性分析。利用Uparse 7.0.1001软件进行聚类分析，根据97%的相似度筛选OTUs代表序列。对OTUs序列进行物种注释，并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。利用SILVA数据库对细菌群落进行分类，利用UNITE数据库对真菌群落进行分类。以各样品中数据量最少的为标准进行均一化处理。使用FAPROTAX数据库进行细菌的功能注释，使用FUNGulid数据库进行真菌的功能注释。