小西葫芦黄花叶病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆

摘 要：病毒侵染性克隆是病毒与寄主互作研究的有力工具，分析了小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）甜瓜分离物CH-87的基因组序列和分子变异，构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。结果显示，CH-87分离物基因组全长为9592 nt，与其他分离物的全基因组核苷酸和多聚蛋白氨基酸的序列一致性平均值分别为91.42%、96.45%。基于CP蛋白和多聚蛋白氨基酸序列的系统进化分析显示，CH-87分离物与美国的BL-67南瓜分离物亲缘关系最近，与中国的CN∶Lc∶17丝瓜分离物亲缘关系次之，均聚于亚组Ⅴ中。接种试验显示，CH-87分离物的克隆具有侵染性，能系统侵染甜瓜、黄瓜、西瓜和西葫芦，经接种产生的病毒后代也具有侵染性。

关键词：小西葫芦黄花叶病毒；甜瓜分离物；基因组；侵染性克隆

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）12-009-07

The genome and infectious clone of zucchini yellow mosaic virus melon isolate

LIU Liming1，2， PENG Bin1， KANG Baoshan1，2， WU Huijie1，2， LIU Xi1，2， GU Qinsheng1，2

（1.Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology/Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453500， Henan， China）

Abstract： Viral infectious clone is a powerful tool for studying the interaction between virus and host.  In this study， the genome sequence of zucchini yellow mosaic virus （ZYMV） melon isolate CH-87 was cloned and analyzed， and its full-length cDNA clone was constructed. The results showed that the genome of isolate CH-87 was 9592 nt in length， and the average nucleotide and amino acid sequence identities between CH-87 and other isolates were 91.42% and 96.45%， respectivly. Phylogenetic analysis based on CP and polyprotein amino acid sequences showed that CH-87 was most closely related to isolate BL-67 from The United States， followed by isolate CN∶Lc∶17 from China， and they all clustered in subgroup Ⅴ. The inoculation showed that the infectious clone was successfully constructed， and it could systematically infect melon， cucumber， watermelon and zucchini. The progeny produced from the clone was infectious by mechanical inoculation.

Key words： Zucchini yellow mosaic virus; Melon isolate; Genome; Infectious clone

小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），通过蚜虫、机械接触和种子进行传播，主要侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、西葫芦等瓜类作物，引起植株生长缓慢、矮化、花叶、蕨叶、新叶变小、果实畸形等，造成巨大经济损失，严重制约瓜果产业的可持续发展。该病毒于1981年在意大利首次发现[1]，1991年在我国新疆首次报道[2]，目前在世界范围内广泛分布[3-4]。

获得ZYMV不同分离物的序列信息，分析其系统进化关系，可以了解它们的发生、起源及变异规律，为防控病害发生提供重要理论依据[5-15]。病毒侵染性克隆的获得使RNA病毒能够在DNA水平上应用基因工程手段研究病毒各基因功能及致病机制。前期笔者团队（中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组）从河南临颖的甜瓜发病植株中分离获得ZYMV分离物CH99/87（CH-87），并对其外壳蛋白基因进行了克隆和序列分析[16]。笔者在此基础上拟通过扩增获得该分离物的全基因组序列，以分析与其他ZYMV分离物之间的序列一致性和系统进化关系，为深入开展该病毒的遗传多样性分析和进化机制研究奠定基础。同时通过构建全长cDNA克隆，分析该克隆在不同瓜类作物上的侵染性，为在瓜类作物上开展该病毒的分子致病性和寄主抗病性等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于 2021 年 4—9 月在中国农业科学院郑州果树研究所进行，ZYMV分离物CH-87分离自甜瓜发病植株，由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组鉴定和保存。

1.2 载体构建

取约0.1 g甜瓜发病叶片，提取叶片总RNA并合成cDNA，具体操作参照RNAsimple总RNA提取试剂盒和PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser说明书。根据NCBI数据库中已知ZYMV分离物的全基因组序列信息，设计4对引物HF-Z-1F/Z-1R、Z-2F/Z-2R、Z-3F/Z-3R、Z-4F/HF-Z-4R（表1），以cDNA为模板，对分离物CH99/87的全基因组进行分段扩增。利用NEBuilder高保真DNA组装预混液将获得的4个PCR产物与经Stu I和Sma I双酶切处理的植物表达载体pXT1（由南京农业大学陶小荣教授馈赠）进行同源重组、转化、菌液PCR筛选、测序验证，最终获得含有CH-87全基因组的cDNA克隆pXT1-ZYMV。

1.3 序列分析

对pXT1-ZYMV进行测序、拼接，获得CH-87分离物的全基因组序列。利用Mega X中的Clustal W对CH-87分离物与NCBI数据库中已知ZYMV分离物的序列进行比对，再用BioEdit软件进行序列一致性分析[17]。以西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus，WMV，AY437609）为外组，分别基于CP蛋白和多聚蛋白的氨基酸序列，利用Mega X软件中的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）对ZYMV分离物进行系统进化分析[18]。

1.4 侵染性分析

试验于2021年6—8月在中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组温室进行。其中，甜瓜品种为白玫，由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供；黄瓜品种为津研4号，种子购自天津科润农业科技股份有限公司；西瓜品种为郑抗2号，由中国农业科学院郑州果树研究所提供；西葫芦品种为欧诺，种子购自太谷区雨润谷禾种业有限公司。当以上瓜类作物植株培养至子叶完全展开时用于试验。将pXT1-ZYMV利用液氮冻融法转入农杆菌GV3101菌株中，利用菌液PCR筛选获得阳性克隆，随后进行扩大培养和接种检测，并将发病叶片进一步进行摩擦接种分析，每次接种甜瓜、黄瓜、西瓜、西葫芦各8株，3次重复，以接种诱导缓冲液的植株为对照，具体农杆菌培养、诱导和接种方法参照刘莉铭等[19]。待接种28 d后，利用引物Z-8284F/Z-T7-9337R对发病叶片进行RT-PCR扩增，分析pXT1-ZYMV在不同瓜类作物中的侵染性，以Z-8927F/Z-T7-9337R为引物，对CH-87分离物基因组的8927～9337 nt区域进行扩增，PCR产物经体外转录获得地高辛标记的RNA探针，利用dot blot方法进一步检测植株叶片中ZYMV的侵染情况。

2 结果与分析

2.1 ZYMV分离物CH-87的基因组

CH-87基因组全长为9592 nt，它的5’UTR和3’UTR分别对应基因组的1～138 nt和9382～9592 nt，全基因组编码1个由3080个氨基酸组成的多聚蛋白（139～9381 nt，9243 nt），经蛋白酶切割，形成10个成熟的蛋白质，包括P1（139～1068 nt，930 nt，310 aa）、HC-Pro（1069～2436 nt，1368 nt，456 aa）、P3（2437～3474 nt，1038 nt，346 aa）、6K1（3475～3630 nt，156 nt，52 aa）、CI（3631～5532 nt，1902nt，634 aa）、6K2（5533～5691 nt，159 nt，53 aa）、NIa-VPg（5692～6261 nt，570 nt，190 aa）、NIa-Pro（6262～6990 nt，729 nt，243 aa）、NIb（6991～8541 nt，1551 nt，517 aa）和CP（8542～9378 nt，837 nt，279 aa），P3编码区内部通过+2移码产生PIPO（2889～3122 nt，234 nt）。其具体基因组结构如图1所示，GenBank登录号为MN296124。

2.2 分离物CH-87序列分析

序列一致性分析表明，分离物CH-87与其他分离物的全基因组核苷酸序列一致性平均值为91.42%，与美国BL-67分离物一致性最高，为97.60%，与韩国分离物KR-PE和KR-PS一致性次之，与澳大利亚分离物Gld-1和Knx-22一致性最低（表2）。分离物CH-87与其他分离物的多聚蛋白氨基酸序列一致性平均值为96.45%，与美国BL-67分离物一致性最高，为99.30%，与韩国分离物BR1一致性次之，与新加坡分离物Singapore一致性最低（表2）。

基于ZYMV CP蛋白氨基酸序列的系统进化分析结果显示，供试45个ZYMV分离物可以分为A、B两组，A组由来自17个国家的40个分离物组成，B组由来自新加坡和澳大利亚的西瓜和西葫芦分离物组成（图2）。其中，A组进一步聚类为5个亚组Ⅰ～Ⅴ。亚组Ⅰ由来自斯洛伐克、印度、捷克、西班牙、埃及、阿根廷、伊朗、土耳其、伊拉克、以色列、澳大利亚和中国台湾的西葫芦、大豆、西印度黄瓜、笋瓜、南瓜、黄瓜和甜瓜分离物组成，亚组Ⅱ由来自澳大利亚和日本的西瓜、黄瓜、西葫芦、帽儿瓜分离物组成，亚组Ⅲ由来自意大利、澳大利亚和特立尼达和多巴哥的西葫芦、甜瓜和南瓜分离物组成，亚组Ⅳ由来自土耳其、韩国和中国的西葫芦和南瓜分离物组成，亚组Ⅴ由来自韩国、中国和美国的甜瓜、南瓜、丝瓜和芝麻分离物组成。而笔者获得的CH-87分离物与美国南瓜分离物（BL-67）亲缘关系最近，与中国丝瓜分离物（CN∶Lc∶17）、芝麻分离物（zz）和韩国的3个南瓜分离物（BR1、KR-PE、KR-PS）亲缘关系次之，它们均聚于亚组Ⅴ中（图2）。