侵染番茄的苎麻花叶病毒分子特征及其基因序列分析
作者: 李淳,刘学辉,卜昶栋,姚胜军,王莉爽
摘 要:为明确侵染贵州番茄的菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒种类及其变异分化情况,将采自贵州省关岭县的番茄病毒病样品提取DNA,用Begomovirus通用引物BegoAFor1/BegoARev1进行PCR检测,并用J4F/J4R引物扩增并克隆该分离物的DNA-A全长序列,用RaMV-B-F/RaMV-B-R扩增并克隆该分离物的DNA-B全长序列,所获序列用MEGA软件构建系统进化树,分析其亲缘关系。结果表明,该分离物序列与已报道Ramie mosaic virus(苎麻花叶病毒,RaMV)序列相比,其DNA-A的核苷酸一致性在94.7%~95.5%之间,DNA-B核苷酸一致性在90.4%~92.4%之间。从系统进化树分析,RaMV-GZ的DNA-A和DNA-B与中国其他地区的RaMV DNA-A和DNA-B序列都聚在一支。综上可知,侵染贵州番茄的Begomovirus为苎麻花叶病毒,且其与中国不同省份的RaMV亲缘关系较近。
关键词:番茄;苎麻花叶病毒;检测;序列分析
中图分类号:S641.2 文献标志码:A 文章编号:1673-2871(2022)01-009-07
Molecular characteristics and gene sequence analysis of Ramie mosaic virus infecting tomato
LI Chun1, LIU Xuehui1, BU Changdong2, YAO Shengjun2, WANG Lishuang1
(1. Institute of Plant Protection, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, Guizhou, China; 2. College of Biology and Engineering, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou, China)
Abstract: In order to clarify the species, variation and differentiation of Begomovirus infecting tomato in Guizhou, DNA was extracted from tomato viral disease samples collected from Guanling County, Guizhou Province, and detected by PCR with Begomovirus universal primers BegoAFor1/BegoARev1. The full-length DNA-A sequence of the isolate was amplified and cloned with J4F / J4R primers, and the full-length DNA-B sequence of the isolate was amplified and cloned with RaMV-B-F / RaMV-B-R, the obtained sequence was used to construct a phylogenetic tree with MEGA software and analyzed its genetic relationship. The results showed that compared with the reported RaMV sequences, the nucleotide similarities of DNA-A and DNA-B was 94.7% -95.5% and 90.4% -92.4% respectively. From the phylogenetic tree analysis, the DNA-A and DNA-B sequences of RaMV-GZ were clustered in one branch with RaMV DNA-A and DNA-B sequences in other regions of China. It indicated that Begomovirus infecting tomato in Guizhou is Ramie mosaic virus, and it was closely related to RaMV in different provinces of China.
Key words: Tomato; Ramie mosaic virus; Detection; Sequence analysis
番茄是贵州发展蔬菜产业的重要作物之一,而病毒病是危害番茄生产的重要病害。目前,危害我国番茄生产的主要DNA病毒有番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)[1]、广东番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl Guangdong virus,ToYLCGDV)[2]、中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)[3]、泰国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl Thailand virus,TYLCTHV)[4]、海南番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Hainan virus,ToLCHNV)[5]、中国番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl China virus,ToLCCNV)[6]、台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,ToLCTWV)[7]、烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)[8]和中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV)[9]9种。而目前我国尚未有苎麻花叶病毒(Ramie mosaic virus,RaMV)危害番茄的报道。因此,对这一新的番茄病毒的危害,应予以足够的重视以确保我国番茄产业的健康良性发展。按照ICTV最新分类标准,苎麻花叶病毒是双生植物真菌病毒目(Geplafuvirales)、双生病毒科(Geminiviridea)、菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)成员[10],大多数菜豆金色花叶病毒属病毒具有双组分的基因组,即DNA-A和DNA-B,大小在2.5~2.8 kb之间。国内外对双生病毒的研究主要集中在基因组结构、传毒介体、传播途径与寄主的互作等方面。Chen等[11]报道了苎麻花叶病毒在中国广东地区侵染西番莲。Peng等[12]研究发现,苎麻花叶病毒对地中海型烟粉虱行为的改变存在性别差异,雌性烟粉虱的传毒效率明显高于雄性。SHEN等[13]研究发现,蛋白激酶SnRK1的过量表达能使植物对双生病毒的抗性增强,沉默SnRK1会增加双生病毒的易感性,SnRK1还能直接磷酸化双生病毒蛋白以减少感染。Kanakala等[14]研究报道,烟粉虱亲环素B(CypB)和热休克70蛋白(hsp70)在病毒传播途径上与TYLCV在烟粉虱中肠内相互作用并共位点定位,这2种蛋白在病毒传播过程中都有重要作用。目前,国内尚未见到苎麻花叶病毒侵染番茄的相关报道,明确该病毒的株系和变异情况对制定相关的防控策略具有重要的指导作用。笔者运用PCR扩增得到了RaMV的DNA-A和DNA-B,分析了该分离物与其他地区及其他作物上分离物的系统进化关系,并分析了不同地区RaMV各基因的核苷酸一致性,以期为科学防控RaMV提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 感病样品采集与试验 疑似番茄病毒病样品于2019年秋季采自贵州省关岭县,品种为金石头番茄D6689(来源于贵阳粒丰种子有限公司代理)。保存在-80 ℃冰箱。以未发病的健康番茄植株叶片作为阴性对照。试验于2020年6—7月在贵州省植物保护研究所植物病理实验室进行。
1.1.2 试剂 TransStart® FastPfu DNA Polymerase、pEASY®-Blunt Simple Cloning Kit、EasyPure® Quick Gel Extraction Kit、2×Easy Taq®PCR SuperMix(Transgen biotech,AS111)、Trans2K® Plus DNA Marker购自北京全式金生物有限公司;其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 总DNA提取 番茄叶片样本总DNA提取采用CTAB法。
1.2.2 PCR扩增与测序 采用刘勇等[15]报道的Begomovirus通用引物BegoAFor1 (5’-TGYGARGGICCITGYAARGTYCARTC-3’)和BegoARev1(5’-ATHCCMDCHATCKTBCTITGCAATCC-3’)进行番茄疑似病毒病样品扩增,酶采用2×Easy Taq® PCR SuperMix。反应程序为95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min 12 s,35个循环;72 ℃ 5 min。
采用Li等[16]设计的RaMV的DNA-A特异性引物J4F(5'-CATGTATCGGAAGCCCAAGATG-3')和J4R(5'-ATGGGCCTGTACGTCCAAGC-3') 扩增DNA-A,体系为Template 2 μL,Forward Primer(10 μmol·L-1)1 μL,Reverse Primer(10 μmol·L-1)1 μL,TransStart® FastPfu DNA Polymerase 1 μL,5X TransStart® FastPfu Buffer10 μL,Nuclease-free Water 35 μL,Total volume 50 μL。反应程序为95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 3 min,35个循环;72 ℃ 5 min。
设计了RaMV的DNA-B特异性引物RaMV-B-F(5'-TGATCAAGTCCCAGAGGAGATTGAATGC-3')和RaMV-B-R(5'-AAGGACGATGATAAGAATGGACTGTAC-3')扩增DNA-B,体系为Template 2 μL,Forward Primer(10 μmol·L-1)1 μL,Reverse Primer(10 μmol·L-1)1 μL,TransStart® FastPfu DNA Polymerase 1 μL,5 × TransStart® FastPfu Buffer 10 μL,Nuclease-free Water 35 μL,Total volume 50 μL。反应程序为95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 3 min,35个循环;72 ℃ 5 min。
PCR扩增产物经回收纯化后克隆到pEASY®-Blunt Simple Cloning Kit 载体,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经过菌落PCR鉴定后,选取阳性克隆进行测序,引物合成及测序由重庆擎科兴业生物科技有限公司完成。
1.2.3 序列分析 利用DNAMAN和BioEdit对不同地区,不同作物上的RaMV的DNA-A和DNA-B及其编码的各基因进行核苷酸序列相似性比较。运用MEGA 7.0的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建基于DNA-A和DNA-B全长核苷酸序列的系统发育进化树,构建DNA-A和DNA-B系统发育进化树采用的双生病毒分离物序列来源见表1和表2。
2 结果与分析
2.1 疑似双生病毒感染的样品检测
用双生病毒通用引物BegoAFor1/BegoARev1对提取的总DNA进行扩增,得到1200 bp产物(图1),回收后连接至T载体,克隆后送样测序,经过Blast比对,确认其为RaMV序列。
2.2 RaMV的DNA-A和DNA-B的全长基因组的克隆与序列分析
以J4F/J4R扩增DNA-A,得到大小 2737 bp的条带(图2),以RaMV-B-F/RaMV-B-R扩增DNA-B,得到大小2709 bp的条带(图3),产物经回收、连接、克隆后送样测序,比对结果表明,其序列为RaMV序列,具有菜豆金色花叶病毒属病毒基因结构的典型特征。图4显示,该病毒DNA-A基因组具有6个开放阅读框,病毒链上有AV1(编码外壳蛋白CP)和AV2(编码移动相关蛋白),互补链上AC1(编码Rep蛋白,转录激活及复制相关),AC3(编码REn蛋白,增强复制)和AC4(沉默抑制子);图5显示,DNA-B具有2个开放阅读框,病毒链有BV1(编码核穿梭蛋白NSP),互补链有BC1(编码运动蛋白MP)。
对病毒编码的DNA-A和DNA-B及各个基因进行核苷酸序列相似性比较(表3、4),结果表明,其DNA-A与各地的分离物的相似性相差不大,一致性在94.7%~95.5%之间,与RaMV-Zhejiang-Z1(FN396971)、RaMV-Jiangsu-J4(FN396969)和RaMV-Fujian(EF125190)的一致性都是95.5%;而体现在基因方面,则在AC2最为保守,一致性在96.3%~98.0%之间,与RaMV-Guangdong(KC171652)的一致性最高,达到了98%;在AV2变异性最高,一致性在91.9%~96.7%之间,RaMV-Guangdong(KC171652)的变异性最高,一致性为91.9%。DNA-B的相似性则相对低一些,一致性在90.4%~92.4%之间,最高为RaMV-Guangdong-Hn(KC171651);BC1和BV1的一致性分别为91.2%~93.4%和91.6%~93.1%,一致性最高的都是RaMV-Guangdong-Hn(KC171651)。